Hbv和/或hdv易感細胞、細胞系和非人動物的開發的制作方法
【專利說明】HBV和/或HDV易感細胞、細胞系和非人動物的開發
[0001] 本發明涉及新穎乙型肝炎病毒（HBV)和/或丁型肝炎病毒（HDV)受體及其用于開 發易受HBV和/或HDV感染且可用于免疫學研宄和/或用于篩選藥物、進入后限制因子和 宿主依賴因子的細胞、細胞系和非人動物的用途。其進一步涉及所述受體用于鑒定可用于 治療HBV和/或HDV感染的化合物的用途。
[0002] 人乙型肝炎病毒（HBV)引起急性和慢性肝臟感染。3. 5億人持續感染（Cornberg 等人，fesiroefliero/ iT/eio/ 2010，56 (4)，451-465)。慢性乙型肝炎仍將是一 個主要的全球健康問題，盡管有疫苗可用。治療（IFNa和五種核苷類似物）是有限的，且 主要是非治愈性的。
[0003] HBV是嗜肝DNA病毒科的成員。嗜肝DNA病毒是最小的包膜DNA病毒，其經由pgRNA 中間體的逆轉錄復制。在裝配過程中，核衣殼獲取稱為大（L)、中（M)和小（S)的三種病毒 包膜蛋白。它們被編碼在一個開放閱讀框中，并且共享對于膜錨定所需的S結構域。除了 S-結構域以外，M含有55個氨基酸的N端親水性延伸（preS2)，而L進一步延伸107、117 或118個氨基酸（基因型依賴性），被稱為preSl (Urban, /7Witfre KiroJr. 2008，3(3)， 253-264)。丁型肝炎病毒（HDV)是利用HBV包膜蛋白用于進入肝細胞的衛星擬病毒。已知 L的肉豆蔻酰化的preSl-結構域在HBV和HDV感染性中發揮關鍵作用。
[0004] 嗜肝DNA病毒顯示顯著的物種特異性。小鼠和大鼠對于HBV是抗感染的事實 已歸因于缺乏一種或多種進入因子或存在進入后限制因子（post-entry restriction factor)。由于將質粒編碼的HBV-基因組遞送至非易感物種的肝細胞促進病毒體分泌，所 以假設宿主約束條件與早期感染事件相關。HBV的另一個特點是在體內選擇性感染肝細胞 的效力。物種特異性和非凡的肝臟向性與HBV感染的早期步驟（例如，特異性受體識別） 相關的假說是有吸引力的。
[0005] 目前，只有原代人（PHH)、原代緬甸樹_ (tupeia belangeri) (PTH)肝細胞和分化 的H印aRG細胞支持完整的HBV復制周期。后者是DMSO處理后能夠分化成PHH樣細胞的肝 祖細胞系。原代小鼠（PMH)和原代大鼠肝細胞（PRH)對于HBV是抗感染的。因此，小鼠和 大鼠既不支持從頭HBV感染，也不支持病毒傳播。（具有免疫能力的）小動物模型的缺乏 是HBV研宄的一個主要障礙，所述HBV研宄要求闡明潛在的分子限制因子。其導致開發替 代系統，如具有超長（over-length) HBV基因組的整合物的HBV轉基因小鼠，或免疫缺陷的 PHH移植的uPA/Scid小鼠。
[0006] 本發明人先前已經鑒定了 HBV L-蛋白衍生的脂肽，其阻斷HBV和HDV感染PHH 和 H印aRG 細胞（Gripon 等人，/Kiro/ 2005，79(3)，1613-1622; Schulze 等人，/ Kiro/ 2010，84(4)，1989-2000; TO 2009/092611 Al)。它們代表了 HBV 的 preSl-結構 域的N-端47個氨基酸（HBVpreS/2-48_)，并且包括天然存在的肉豆蔻酸修飾。由于細胞 與^3\^^3/2-48_預孵育阻斷感染，因此它們據推測針對受體（address a receptor)，然 而，所述受體是迄今未知的。
[0007] 因此，本發明的一個目標是鑒定負責這些HBV L-蛋白衍生脂肽的結合的受體。
[0008] 本發明的一個進一步目標是開發通過表達所述受體易受HBV和/或HDV感染的細 胞和細胞系。
[0009] 本發明的又一個進一步目標是提供易受HBV和/或HDV感染的非人轉基因動物。
[0010] 此類轉基因細胞、細胞系和動物然后可用于免疫學研宄和/或用于篩選藥物、進 入后限制因子和宿主依賴因子（host dependency factor)。此外，新鑒定的受體可用于鑒 定可用于治療HBV和/或HDV感染的進一步化合物。
[0011] 本發明的目標通過乙型肝炎病毒（HBV)或丁型肝炎病毒（HDV)受體解決，所述乙 型肝炎病毒（HBV)或丁型肝炎病毒（HDV)受體具有 (a) SEQ ID NO: 1代表的氨基酸序列，或 (b) 包含以下的氨基酸序列， SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2至少90%、優選至少91%、更優選至少92%相同的氨 基酸序列，和 具有通式Pro-Tyr-X-Gly-Ile [SEQ ID N0:11]的氨基酸序列，其中X選自Lys、Arg和 Val0
[0012] 本發明的目標還通過乙型肝炎病毒（HBV)或丁型肝炎病毒（HDV)受體解決，所述 乙型肝炎病毒（HBV)或丁型肝炎病毒（HDV)受體具有 (a) SEQ ID NO: 1代表的氨基酸序列，或 (b) 包含以下的氨基酸序列， SEQ ID NO:2或與SEQ ID NO:2至少90%、優選至少91%、更優選至少92%相同的氨 基酸序列，和 在對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸158的位置具有Gly或在對應于SEQ ID NO: 1的氨基 酸158和159的位置具有序列Gly-IIe。
[0013] SEQ ID N0:1是人牛磺膽酸鈉協同轉運多肽NTCP/SLC10A1。
[0014] 在本發明的優選實施方案中，"SEQ ID NO: 1代表的氨基酸序列"是指與SEQ ID NO :1至少90%、優選至少91%、更優選至少92%、更優選至少95%或99%相同或與SEQ ID NO: 1相同的氨基酸序列。
[0015] 所述氨基酸序列（b)優選包含兩個區域或結構域： (1) 包含人NTCP的氨基酸265至291 (或具有至少90、91或92%同一性的序列）的區 域或結構域 QL：：HT i LNvAfr VIG?Lr'f r'rLLYH [SEQ ID NO： 2}； (2) 包含具有以下通式的氨基酸序列的區域或結構域 PYXG I： [SEQ ID NO: 11], 其中X選自K、R和V。
[0016] 在一個實施方案中，所述氨基酸序列（b)的區域或結構域（2)包含（至少） -Gly，其在對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸158的位置， 諸如在具有通式PYXGI [SEQ ID NO. : 11]的氨基酸序列中； 或 -包含或具有在對應于SEQ ID NO: 1的氨基酸158和159的位置的序列Gly-Ile， 諸如在具有通式PYXGI [SEQ ID NO. :11]的氨基酸序列中。
[0017] 在一個實施方案中，所述氨基酸序列（b)不包含多于450個氨基酸，優選不多于 400個氨基酸。
[0018] 在一個實施方案中，所述氨基酸序列（b)進一步包含氨基酸序列 Gly-Mei-Ilc-IIe-Ilc-l.w-Lcu [SIiQ II) NO: 1。
[0019] 在該實施方案中，所述氨基酸序列（b)包含三個區域或結構域： (1) 包含人NTCP的氨基酸265至291 (或具有至少90、91或92%同一性的序列）的區 域或結構域 Cl'心 S T 了 I ,N YA F P P F'V 1： G F: L FFF PI ,I { SEQ JD NO； 2]； (2) 包含具有以下通式的氨基酸序列的區域或結構域 PrXGl fSEQiDNO: 11], 其中X選自K、R和V。
[0020] (3)包含以下氨基酸序列的區域或結構域 G^TIILL [SEQ ID NO: 12]。
[0021] 本發明的目標還通過如上定義的具有選自SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3至8的氨 基酸序列的HBV或HDV受體來解決。
[0022] 本發明的目標還通過編碼如上定義的HBV或HDV受體的分離的核酸序列、優選DNA 序列來解決。
[0023] 本發明的目標還通過包含如上定義的核酸序列的載體來解決。
[0024] 在一個實施方案中，所述載體是病毒轉移載體，優選選自慢病毒載體、逆轉錄病毒 載體、皰瘆病毒載體、腺病毒載體、桿狀病毒載體和腺伴隨病毒（AAV)載體。慢病毒載體允 許產生穩定細胞系，腺病毒載體和AAV可用于體外轉導原代肝細胞或體內轉導小鼠，并且 使它們瞬時易受HBV和/或HDV感染。
[0025] 本發明的目標還通過包含如上定義的載體或包含如上定義的核酸序列的宿主細 胞來解決，所述載體或核酸序列已被人為引入所述宿主細胞。
[0026] 在一個實施方案中，術語"人為引入"是指這樣的事實，所述核酸序列在非內源性 啟動子，例如天然不與所述宿主細胞中的所述核酸序列聯系的啟動子的控制下表達。
[0027] 根據本