一種構建高通量測序文庫的方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程及分子生物學領域，具體涉及一種構建高通量測序文庫的方法。
【背景技術】
[0002]高通量測序技術(High-throughputsequencing)又稱“下一代”測序技術，以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。根據發展歷史、影響力、測序原理和技術不同等，主要有以下幾種:大規模平行簽名測序、聚合酶克隆、454 焦磷酸測序、Illumina sequencing、ABISOLiD sequencing、離子半導體測序、DNA 納米球測序等。高通量測序技術是對傳統測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序。
[0003]現有技術中，構建高通量測序文庫的方法包括:將基因組DNA片段化；將DNA片段進行末端修復；在經過末端修復的DNA片段的3’末端添加堿基A ;將具有粘性末端A的DNA片段與甲基化接頭相連；利用特異性探針對所述連接產物進行雜交捕獲，以便獲得目的片段；將所述目的片段進行重亞硫酸鹽處理，以便將所述目的片段中非甲基化的胞嘧啶轉換為尿嘧啶；將經過轉換的目的片段進行PCR擴增；分離純化擴增產物，該擴增產物構成高通量測序文庫。采用本發明的構建高通量測序文庫的方法及其應用，能夠方便有效地構建樣本的基因組特定區域的高通量測序文庫。現有技術還存在建庫效率較低，試劑、樣品損耗大，信息不完整的問題，需要構建新方法來解決。
【發明內容】
[0004]本發明的一個目的是一種構建高通量測序文庫的方法，包括以下步驟
(1)樣品DNA提取及定量；
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:打斷DNA，溫度在20°C以下，純化回收；
(3)DNA片段質量評價；
(4)DNA片段平端化:補平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
(5)接頭連接磷酸:接頭5’鏈末端是引物端，帶有生物素，在接頭的一側有標簽，其中平端化的接頭5’末端連接磷酸基團；
(6)DNA片段連接接頭:連接磷酸基團后，接頭通過連接酶與平端化的DNA片段相連；
(7)DNA文庫固定；
(8)小片段去除，PCR擴增，得到雙鏈DNA文庫；
(9)DNA文庫分離:對DNA文庫進行變性，將未結合生物素的DNA片段洗脫下來，即為測序文庫。
[0005]所述打斷DNA使用Covaris超聲波打斷儀。
[0006]所述打斷DNA使DNA樣品成為400_700bp。
[0007]所述純化回收為先用Qiagen的MinElute進行純化，然后使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳膠回收或Double SPRI bead方法回收，優選為使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳膠回收；回收選取450-700bp的片段。
[0008]所述質量評價米用Agilent 的 B1analyzer DNA 7500 LabChip。
[0009]所述與平端化的DNA片段相連采用的連接酶為T4連接酶，所述連接磷酸使用T4多聚核苷酸激酶，連接6小時以上。
[0010]所述連接磷酸后的接頭為接頭a:
5' GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3r3' GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5'，
接頭a的標簽為GCATCACT和CGTAGTGA。
[0011]所述連接磷酸后的接頭為接頭b:
5' GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3'
3' CCTAGCTGCATACGTCACACGAGTCAGTGATCTp 5'，
接頭b的標簽為TCACTAGT和AGTGATCT。
[0012]所述小片段的去除利用AMPure磁珠，去除多余的接頭和其他小片段。
[0013]所述PCR擴增采用化學修飾熱啟動taq酶。
[0014]所述PCR擴增采用高保真DNA聚合酶。
[0015]所述DNA文庫固定，為連有接頭的DNA片段通過接頭帶有的生物素與鏈霉素抗生物素蛋白磁珠上的鏈霉親和素結合，固定在磁珠上。
[0016]使用KOH溶液對DNA文庫進行變性，KOH溶液的濃度為0.6mol/L。
[0017]所述洗脫未結合生物素的DNA片段，使用M280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠。
[0018]本發明構建的文庫容量大，與待測核酸配對的成功率高。其中的Y接頭，節省了篩選不同連接產物的時間，提高了建庫效率。方法中的T4多聚核苷酸激酶能夠高效的連接磷酸基團。測序接頭序列長度較長，連接效率高。使用本發明構建的測序文庫，能夠簡單、高效地構建高通量測序文庫，高效的利用測序板，提高了文庫構建的成功率，降低了樣品和試劑的損耗。得到的測序文庫純度高、信息完整，能夠高效地捕獲目的片段，獲得精確的測序結果。
【具體實施方式】
[0019]實施例1
(1)樣品DNA提取及定量；
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:使用Covaris超聲波打斷儀打斷DNA，使DNA樣品成為400-700bp，溫度為20°C，先用Qiagen的MinElute進行純化，然后使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳膠回收，回收選取450-700bp的片段；
(3)米用Agilent 的 B1analyzer DNA 7500 LabChip 進行 DNA 片段質量評價；
(4)DNA片段平端化:補平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
(5)接頭連接磷酸:接頭5’鏈末端是引物端，帶有生物素，使用T4多聚核苷酸激酶在接頭一側標簽處，平端化的5’末端連接磷酸基團，連接7小時，得到接頭a，
5' GCAAGTCTCGATTGGAGCTCTGCTCCAGTGCATCACT 3r3' GTACATGCACGACTCAGTCCTGATCCGTAGTGAp 5'，
標簽為 GCATCACT 和 CGTAGTGA;
(6)DNA片段連接接頭:連接磷酸基團后，接頭通過T4連接酶與平端化的DNA片段相連，連接6小時；
(7)連有接頭的DNA片段通過接頭帶有的生物素與鏈霉素抗生物素蛋白磁珠上的鏈霉親和素結合，固定在磁珠上；
(8)利用AMPure磁珠，去除多余的接頭和其他小片段，使用熱啟動高保真taq酶進行PCR擴增，擴增體系為:每Iml擴增混合液中包含，0.50X l(T3mmol MgCl2,50 μ I DNA聚合酶、160 μ I dNTP、150 μ I 引物、10 μ I BSAU30 μ I emPCR助劑和 100 μ I 1X 反應液，余量為水，得到雙鏈DNA文庫；
(9)DNA文庫分離:使用0.6mol/L的KOH溶液對雙鏈DNA文庫進行變性，使用M280鏈霉素抗生物素蛋白磁珠將未結合生物素的DNA片段洗脫下來，即為測序文庫。
[0020]實施例2
(1)樣品DNA提取及定量；
(2)DNA片段化、純化及片段選擇:使用Covaris超聲波打斷儀打斷DNA，使DNA樣品成為500-700bp，溫度為18°C，先用Qiagen的MinElute進行純化，然后使用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳膠回收，回收選取500-700bp的片段；
(3)米用Agilent 的 B1analyzer DNA 7500 LabChip 進行 DNA 片段質量評價；
(4)DNA片段平端化:補平5’端缺口，去除3’端的粘性末端；
(5)接頭連接磷酸:接頭5’鏈末端是引物端，帶有生物素，使用T4多聚核苷酸激酶在接頭一側標簽處，平端化的5’末端連接磷酸基團，連接8.5小時，連接磷酸后的接頭為接頭b:
5' GTCGTACAGCTAGTCCTGAGGATGCAGTTCACTAGT3'