一套用于快速鑒定8種重要豆象種類的特異性引物及其試劑盒和檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物檢測鑒定技術，具體地說涉及對8種重要豆象分子鑒定的特異性 引物及快速分子鑒定方法。
【背景技術】
[0002] 豆象科（Bruchidae)昆蟲具有普遍意義上的檢疫性有害生物所具有的共同特征， 即潛在重大經濟重要性、通過人為傳播途徑而擴散、無分布或分布未廣、防治困難等，受到 世界上多數國家的關注。美國、日本、智利、波蘭等國將豆象科昆蟲整體確定為檢疫性有害 生物；保加利亞、捷克等將瘤背豆象屬Callosobruchus spp.列入檢疫性有害生物名錄。
[0003] 豆象的大多數種類已在世界各地廣泛分布，主要是人為的因素在大陸內或大陸間 的貿易造成的。比如，四紋豆象（Callosobruchus maculatus)是上世紀60年代隨港澳旅 客攜帶的豆類傳入的，現已蔓延到廣東、廣西等省區。巴西豆象（Zabrotes subfasciatus) 也隨著國際貿易而擴散至整個熱帶和亞熱帶地區并成功定殖。中國口岸檢疫部門頻繁截獲 到重要的豆象種類。1998年4月16日，揚州動植物檢疫局在泰州港對一艘來自韓國的巴拿 馬籍貨輪登輪檢疫時，在其食品干貨艙內的食用菜豆中截獲大量菜豆象（Acanthoscelides obtectus)〇
[0004] 在豆象的生活史中，雌成蟲將卵產于豆莢或豆粒表面，卵孵化后即鉆入豆粒內完 成幼蟲、蛹與成蟲的發育歷程。隨著我國加入WT0,農產品貿易日益頻繁。在出口或進口豆 科植物時，中國口岸檢疫部門頻繁截獲到重要的豆象種類。其中，綠豆象Callosobruchus chinensis (Linnaeus)、四紋豆象Callosobruchus maculatus (Fabricius)、香豆象Bruchus rufimanus (Boheman)、碗豆象 Bruchus pisorum(Linnaeus)、鷹嘴豆象 Callosobruchus analis(Fabricius)、灰豆象 Callosobruchus phaseoli(Gyllenhall)、菜豆象 Acanthoscelides obtectus (Say)和巴西豆象Zabrotes subfasciatus (Boheman)都屬于豆 象科，是重要的倉儲害蟲，危害多種豆科植物，屬于檢疫性害蟲。
[0005] 而這幾種豆象有的外部形態非常相似，由于傳統形態分類要求對象物種標本的完 整性以及對其生物學的詳細了解使得常規的形態分類進行鑒定十分困難，如果截獲的豆象 是處于幼蟲期，則更增加了鑒定的難度。目前國內外對其檢測識別僅限于形態上，未見有關 其分子鑒定方法的研宄。即使是通過傳統的分子檢測方法，利用DNA測序技術雖然能夠準 確鑒定，但一方面測序成本比較高，另一方面測序過程所需時間周期比較長，達不到快速的 要求。因此目前需要盡快建立一套快速靈敏的鑒定檢測方法，以便對這八種豆象作出準確、 快速的鑒定，從而確保對外貿易的正常發展。
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供一套用于快速鑒定八種重要豆象種類的特異性引物，它能滿足 現有技術的上述需求。
[0007] -套用于快速鑒定八種重要豆象種類的特異性引物，其序列如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2 ; SEQ ID NO. 3 和 SEQ ID NO. 4 ; SEQ ID NO. 5 和 SEQ ID NO. 6 ;SEQ ID NO. 7 和 SEQ ID NO. 8 ;SEQ ID NO. 9 和 SEQ ID NO. 10 ;SEQ ID NO. 11 和 SEQ ID NO. 12 ;SEQ ID NO. 13 和 SEQ ID NO. 14 ;SEQ ID NO. 15 和 SEQ ID NO. 16 所示。
[0008] 本發明還公開了幾種重要豆象線粒體COI基因序列擴增方法，是采用上述的引 物，用50 μ I PCR體系在特定PCR擴增條件下進行目標片段擴增。
[0009] 所述的 50 μ I PCR 體系是：5 μ I 10Xbuffer(+Mg2+)，2· 5 μ I dNTP(2. 5mM)，3 μ 1 引物 LeC0I-F(10yM)，3yl 引物 LeC0I-R(10yM)，0.5yl rTaq 酶（5μ/μ1)，2μ1 DNA 模 板（IOOng)，34 μ 1 雙蒸水。
[0010] 所述的PCR擴增條件是：94°C預變性5分鐘，94°C變性1分鐘15秒，退火溫度 (Tm) 1分鐘15秒，72°C延伸1分鐘5秒，共35個循環，最后72°C延伸10分鐘。
[0011] 本實驗從分子水平依據八種豆象線粒體COI基因設計出八種引物，利用這八種引 物在相同的PCR程序下進行擴增，結果顯示這八種引物的擴增結果及其擴增組合能夠有效 快速地區分出八種豆象。同時每種豆象都設置了 4個重復，結果顯示該套引物對于不同的 豆象以及同種豆象的4個重復均體現出較好的穩定性，保證了鑒定結果的準確性，說明該 套引物具有較高的靈敏度，填補了豆象科昆蟲無分子鑒定方法的空白。
[0012] 另外，可以將本發明引物以及相關試劑組裝成試劑盒，以方便使用。本發明的試劑 盒可以是由多個隔斷所形成，以容納固定一個或多個如管或小瓶的容器。這些容器之一或 者多個可以裝有本發明的引物，根據需要該引物可以是凍干形式或溶于緩沖液中的狀態。 另外，本發明的試劑盒中還可以包括用于PCR反應的一種或多種酶/試劑，以及實施本發 明所需要的其它成分及用具。該試劑盒能夠同時快速準確地鑒別出綠豆象，四紋豆象，蠶 豆象，豌豆象，鷹嘴豆象，灰豆象，菜豆象和巴西豆象八種豆象，同時該試劑盒檢測方法無需 對反應體系及反應程序進行調整，而且整個檢測過程（包括PCR反應和電泳檢測）耗時不 到3小時，大大縮短了檢測時間。本試劑盒的缺點是必須確定待測樣品屬于綠豆象，四紋豆 象，蠶豆象，豌豆象，鷹嘴豆象，灰豆象，菜豆象和巴西豆象才能適用，一旦超出這八種豆象 范圍，該試劑盒不再適用，但可以根據需要重新設計一對或多對上游引物，利用其擴增結果 及其組合，在原來試劑盒的基礎上重新修改構成一個新的試劑盒，因此，利用該種方法構建 的試劑盒可控性很好，可以隨時根據檢疫對象而擴大試劑盒的檢測范圍。能顯著降低實驗 成本，縮短實驗周期，提高實驗的準確性。
[0013] 本研宄建立了適合口岸應用的簡便的檢測方法，即直接從進、出境的豆科類材料 上檢測豆象，操作快捷、結果準確，避免了用傳統的形態分類學和細胞學方法所產生的耗費 時間和易疏漏的缺陷，順應了當今口岸檢測工作的特點。
【附圖說明】
[0014] 圖1是本發明引物對SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2擴增八種豆象電泳檢測圖譜。
[0015] 其中，泳道1-4號為蠶顯象，5-8號為豌顯象，9-12號為綠顯象，13-16號為四紋顯 象，17-20號為鷹嘴豆象，21-24號為菜豆象，25-28號為巴西豆象，29-32號為灰豆象，M為 Marker DL 2000〇
[0016] 圖2是本發明引物對SEQ ID NO. 3和SEQ ID NO. 4擴增八種豆象電泳檢測圖譜。
[0017] 其中，泳道1-4號為蠶豆象，5-8號為豌豆象，9-12號為綠豆象，13-16號為四紋豆 象，17-20號為鷹嘴豆象，21-24號為菜豆象，25-28號為巴西豆象，29-32號為灰豆象，M為 Marker DL 2000〇
[0018] 圖3是本發明引物對SEQ ID NO. 5和SEQ ID NO. 6擴增八種豆象電泳檢測圖譜。
[0019] 其中，泳道1-4號為蠶顯象，5-8號為豌顯象，9-12號為綠顯象，13-16號為四紋顯 象，17-20號為鷹嘴豆象，21-24號為菜豆象，25-28號為巴西豆象，29-32號為灰豆象，M為 Marker DL 2000〇
[0020] 圖4是本發明引物對SEQ ID NO. 7和SEQ ID NO. 8擴增八種豆象電泳檢測圖譜。
[0021] 其中，泳道1-4號為蠶顯象，5-8號為豌顯象，9-12號為綠顯象，13-16號為四紋顯 象，17-20號為鷹嘴豆象，21-24號為菜豆象，25-28號為巴西豆象，29-32號為灰豆象，M為 Marker DL 2000〇
[0022] 圖5是本發明引物對SEQ ID NO. 9和SEQ ID NO. 10擴增八種豆象電泳檢測圖譜。
[0023] 其中，泳道1-4號為蠶顯象，5-8號為豌顯象，9-12號為綠顯象，13-16號為四紋顯 象，17-20號為鷹嘴豆象，21-24號為菜豆象，25-28號為巴西豆象，29-32號為灰豆象，M為 Marker DL 2000〇
[0024] 圖6是本發明引物對SEQ ID NO. 11和SEQ ID NO. 12擴增八種豆象電泳檢測圖譜。 其中，泳道1-4號為蠶豆象，5-8號為豌豆象，9-12號為綠豆象，13-16號為四紋豆象，17-20 號為鷹嘴顯象，21-24號為菜顯象，25-28號為巴西顯象，29-32號為灰顯象，M為Marker DL 2000 〇
[0025] 圖7是本發明引物對SEQ ID NO. 13和SEQ ID NO. 14擴增八種豆象電泳檢測圖譜。 其中，泳道1-4號為蠶豆象，5-8號為豌豆象，9-12號為綠豆象，13-16號為四紋豆象，17-20 號為鷹嘴顯象，21-24號為菜顯象，25-28號為巴西顯象，29-32號為灰顯象，M為Marker DL 2000 〇
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