一種早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，特別涉及一種采用煙堿特異引物PCR擴增且根據特征帶譜早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，屬于煙草種植技術領域。
【背景技術】
[0002]已有研宄表明，普通煙草主要包括四種生物堿:煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿四種。普通煙草屬于煙堿積累型，煙堿占總生物堿含量的90%以上，降煙堿是第二大生物堿，但一般也只占總生物堿含量的2-5%，另外兩種生物堿含量極低。降煙堿亦稱為去甲基煙堿，主要由煙堿在去甲基化酶的作用下脫甲基形成。雖然降煙堿含量較低，但由于降煙堿易于在煙葉調制和陳化過程中在微生物和亞硝酸鹽聯合作用下發生亞硝化反應，生成具有致癌作用的煙草特有亞硝胺(TSNAs)，另外，也會降低煙葉香味品質，影響煙葉使用價值。卷煙中有25-45%的TSNAs直接來自于煙葉，因此，降低煙葉TSNAs含量、提高卷煙安全性已成為國際煙草屆的共識和關注焦點。
[0003]自上個世紀50年代起，研宄人員開始關注煙堿轉化的遺傳控制機理，研宄表明，該性狀受兩個連鎖的顯性基因位點(；和Ct控制，分別來源于煙草祖先中林煙草和絨毛狀煙草，因連鎖而呈單基因顯性遺傳特點。隨著生物化學和分子生物學技術的進步，首先確認了煙堿在煙堿去甲基化酶(nicotine N-demethylase, NND)的催化下去甲基合成降煙堿的生化過程；另外，采用群體遺傳學分析、化學誘變、芯片雜交、同源克隆、酵母表達、轉基因等技術先后克隆和分析了五個控制煙堿轉化過程的關鍵基因:CYP82E2、CYP82E3、CYP82E4vl、CYP82E5v2和CYP82E10，其中前兩個基因在普通煙草中因進化過程中發生替換突變而失去了編碼有活性的NND酶的功能，CYP82E4vl是控制煙堿轉化最主要的基因，屬于衰老誘導型基因，CYP82E5v2和CYP82E10是煙堿轉化的次要影響基因，分別在鮮葉和根部特異表達。
[0004]2010年，中國煙草基因組計劃正式啟動，2013年底完成林煙草、絨毛狀煙草和栽培煙草三個煙草的全基因組測序和組裝，本發明人利用煙草全基因組數據，對已克隆的五個基因在自有高、低煙堿轉化極端表型煙草材料中進行了基因組和表達譜的多態性檢測，結果未發現可靠多態性和顯著的表達水平差異，這表明自有材料中可能存在新的影響煙堿轉化的基因位點，采用SRAP和SSR標記對高、低煙堿轉化極端表型材料進行了集團分離分析法(Bulked Segregat1n Analysis，BSA)，其中有I個SSR標記在這兩個材料之間表現出穩定的遺傳多態性，且為共顯性標記，所擴增的PCR產物大小分別為325bp和256bp，相差69bp，用濃度為2%的瓊脂糖凝膠可清晰展示其差異，該SSR標記成為本發明中所使用的煙堿轉化特異引物，自有材料的基因型和表現型吻合度驗證表明，該特異引物穩定可靠，可用于高、低煙堿轉化材料篩選。
[0005]目前，育種上常用團棵期乙烯誘導煙堿轉化的方法來提前鑒定煙株煙堿轉化高低屬性(專利:一種誘導煙草煙堿提前轉化方法及其應用，ZL2007100540828)，這樣可以節約時間和經濟成本，具體操作方法簡述為:取團棵期煙葉(由下至上取7-10葉位定型葉2-3片)，噴施I %的乙烯水溶液后保濕晾制，4至6天煙葉完全變黃后，及時去掉主脈，60°C烘干，粉碎制樣檢測煙堿和降煙堿含量，計算出煙堿轉化率，以此判斷煙株的煙堿轉化高低屬性，再進行田間轉化株剔除。本方法雖然可靠有效，但存在以下不足:1、取樣時期在移栽后的團棵期，仍然偏遲，剔除轉化株后浪費了田地，且難以保證目標群體大小；2、需化學藥品誘導方可；3、鑒定結果受環境因素影響:比如藥品濃度、調制溫度和時間、化學檢測的影響因素等。因此，雖有較好的借鑒作用，但仍不夠高效與及時，無法滿足現實的需求。
[0006]煙堿轉化率計算公式為:煙堿轉化率=100*降煙堿含量/(降煙堿含量+煙堿含量)，本發明中的高煙堿轉化株指的是煙堿轉化率>50%的煙株，低煙堿轉化株指的是煙堿轉化率〈5%的煙株。
【發明內容】
[0007]本發明為解決現有技術的不足提供一種早期鑒定和篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，具體為一種早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，將鑒定時期從團棵期提前到播種前，而且鑒定手段簡單，精準高效，試驗效果只決定于其內在的遺傳物質而不受外部環境條件的影響，這為提高煙葉安全性和改善煙葉品質，為低危害煙葉開發奠定了堅實的理論與技術基礎。
[0008]一種早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，具體步驟依次如下:
[0009]A、在超凈工作臺上，將用于高和低煙堿轉化株篩選的煙草種子(含對照品種)放入已標識的2ml無菌離心管中，倒入濃度為70-75%的乙醇進行表面消毒50_60s，無菌水漂洗I次，時間為3-5min，用移液槍吸走無菌水，再用飽和次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液消毒8-10min，封蓋上下翻動多次以充分消毒，無菌水漂洗多次以去除殘留的Ca(ClO)2溶液，用移液槍吸走無菌水后，用去尖頭的槍頭吸取消毒后的種子播種于MS固體培養基上，往培養基中加l_2ml無菌水，保證種子的正常吸脹發芽，消毒、封口后輕輕搖晃培養基，使種子在培養基中分布均勻，標識后置于光照培養室發芽；
[0010]B、待煙苗長出5-6片真葉后，每個材料各取3株，每株采集1-2片真葉，采用CTAB小樣法提取基因組總DNA，純化后-20°C保存備用；
[0011]C、基因組DNA的PCR反應:用紫外分光光度計測定B步驟中DNA的濃度，然后將其濃度稀釋成50-60ng/ μ L作為DNA反應模板進行PCR反應，所采用的煙堿轉化特異引物序列:
[0012]正向引物:5’-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3’，
[0013]反向引物:5’-TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3’ ；
[0014]D、PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳及電泳結果的讀取:將步驟C中所獲得的PCR擴增產物與溴酚藍-甘油溶液以4:1的體積比混合，注入濃度為2%的瓊脂糖凝膠樣品槽中，同時注入10bp的DNA ladder，通電開始電泳，結束后取出凝膠，清除表面的溴化乙錠(EB)溶液，然后將膠板放入凝膠成像系統的觀察板上，在波長為254nm的紫外燈下進行觀察，拍照并記錄電泳圖譜以備比較分析；
[0015]E、煙草高和低煙堿轉化株篩選:用C步驟中的煙堿轉化特異引物PCR擴增高煙堿轉化，標準為:煙堿轉化率>50%，煙堿轉化率=100*降煙堿含量/ (降煙堿含量+煙堿含量)，下同；低煙堿轉化，標準為:煙堿轉化率〈5%，下同，對照品種獲得的PCR特征帶譜作為鑒定和篩選高、低煙堿轉化株的依據。凡能擴增出與高煙堿轉化對照材料一致的特征帶譜的煙草材料可被確定為高煙堿轉化株，同理，凡能擴增出與低煙堿轉化對照材料一致的特征帶譜的煙草材料可被確定為低煙堿轉化株，除此兩種情況之外的材料不予選擇。被篩選出的高、低煙堿轉化煙苗保留備用。
[0016]在步驟A中的飽和Ca(ClO)2溶液濃度為10%，其消毒時間為8_10min ;無菌水沖洗2-3次，每次為3-5min。
[0017]在步驟C中的煙堿轉化特異引物序列為:
[0018]正向引物:5’-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3’，
[0019]反向引物:5’-TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3’ ；
[0020]PCR 反應體系為:2.5 μ L 帶(NH4) #04的 1X 反應緩沖液，MgCl 22.0mmoI/L, dNTPs200 μ mol/L，1.2U Tag酶，50ng模板DNA，正向和反向引物各0.45 μ mol/L，不足部分用ddH20補足，總體積為25 μ L ;反應程序為:第一階段在94°C環境下反應4min，第二階段在940C的環境下反應30s，第三階段先在55°C環境下反應35s，然后在72°C的環境下反應90s，第二和第三階段共循環28次；第四階段在72°C環境下反應4min，并在4°C的環境下保存。
[0021]在步驟D中，PCR產物的瓊脂糖凝膠電泳過程中，在樣品進膠前用6.5V/cm的電壓，防止樣品擴散，樣品進膠后，應控制電壓不高于5V/cm。
[0022]本發明所涉及的一種早期篩選煙草高和低煙堿轉化株的方法，具有精準高效、操作簡便、易于推廣，可用于播種前的煙草高、低煙堿轉化株的篩選，可極大提高品種群體尤其是親本群體的非轉化株比例，可用于煙草親本種子提純和種子煙堿轉化性狀鑒定，可降低平均煙堿轉化率，提高煙葉質量，為早期鑒定和篩選低有害物質特有亞硝胺(TSNAs)煙株開辟了一條新的高效途徑。本發明適用范圍于白肋煙、馬里蘭煙、香料煙、烤煙和其它地方晾曬煙的常規種和雄性不育雜交種的品種選育和原種提純。
【具體實施方式】
[0023]下面結合實施例對本發明作進一步說明。
[0024]實施例1、白肋煙高和低煙堿轉化株的早期篩選，其具體步驟依次如下:
[0025]A、在超凈工作臺上，將用于高和低煙堿轉化株篩選的白肋煙品種10份(含2份對照品種:B37高煙堿轉化材料，轉化率為85% ；B37低煙堿轉化材料，轉化率為3.1% )分別放入已標識的2ml無菌離心管中，倒入濃度為70%的乙醇進行表面消毒60s，無菌水漂洗I次，時間為3min，用移液槍吸走無菌水，再用濃度為10%的飽和次氯酸鈣(Ca(ClO)2)溶液消毒8min，封蓋上下翻動多次以充分消毒，無菌水漂洗3次，每次3min，以去除殘留的Ca(ClO)2溶液，用移液槍吸走無菌水后，用去尖頭的槍頭吸取消毒后的種子播種于MS固體培養基上，往培養基中加1.5ml無菌水，保證種子的正常吸脹發芽，消毒、封口后輕輕搖晃培養基，使種子在培養基中分布均勻，標識后置于光照培養室發芽培養；
[0026]B、待煙苗長出5片真葉后，每個材料各取3株，每株采集1-2片真葉，采用CTAB小樣法提取各煙草品種基因組總DNA，純化后-20°C保存備用；
[0027]C、基因組DNA的PCR反應:用紫外分光光度計測定B步驟中DNA的濃度，然后將其濃度稀釋成50ng/ μ L作為DNA反應模板進行PCR反應，所采用的煙堿轉化特異引物序列:
[0028]正向引物:5，-ATTGGCCCAATTGCCAAATGGATTACTGC-3，，
[0029]反向引物:5’ -TGCGAGTCGAGCGTACTCAATCTAT-3 ’ ；
[0030]D、PCR擴增產物的瓊脂糖