Egfr基因突變檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種EGFR基因突變檢測試劑盒及其應用，具體涉及一種與腫瘤用藥 選擇和診斷相關的EGFR基因突變的快速檢測。屬于生物技術和醫學領域。
【背景技術】
[0002] 世界衛生組織在2014年的世界癌癥日到來之際發表《世界癌癥報告》稱，癌癥已 經成為全世界人類最大致死原因，發病率和死亡率均呈持續上升趨勢。全球癌癥發病率四 年中升高11%，到2012年約有1410萬病例，因癌癥死亡人數高達820萬。2012年的全球 癌癥新病例中有一半發生在亞洲，其中大部份發生在中國大陸。并預測未來20年內，世界 癌癥病例將增長75%，達到近2500萬。中國腫瘤登記中心2013年初發布《2012中國腫瘤 登記年報》顯示，中國每年新發癌癥病例約達312萬，死亡病例超過200萬，每分鐘有6個人 被確診為癌癥，每天有8550人成為癌癥患者，每7到8人中就有一人因癌癥而死。肺癌、胃 癌、直腸癌、肝癌、食管癌成為中國人患病最多的癌癥，乳腺癌、結直腸癌等癌癥患者亦呈明 顯上升趨勢。隨著環境惡化，水質污染、霧霾以及食品安全方面形勢的逐步嚴峻，專家預測， 中國每年的癌癥新發病例總數到2020年將達到400萬左右，每年病例總數將達到600萬。
[0003] 肺癌是世界上發病率和死亡率最高的惡性腫瘤，又稱原發性支氣管肺癌，根據其 生物學特性可分為小細胞肺癌（Small Cell Lung Cancer，SCLC)和非小細胞肺癌（Non Small Cell Lung Cancer，NSCLC)兩大類，NSCLC主要包括鱗癌、腺癌、大細胞癌和腺鱗癌 等，約占肺癌的80 %~85%，大量的研宄發現，某些基因變異與肺癌，尤其是與NSCLC型 肺癌的發生密切相關，以這些基因突變作為靶標研制的靶向藥物療效顯著，比如EGFR、ALK 等。腫瘤的基因突變圖譜具有地域性差異，EGFR基因突變在亞洲NSCLC患者中的突變頻率 可以達到60%以上。我國中科院季宏斌教授研宄分析了 202份肺腺癌患者的組織標本，其 中在近69%的病人中檢測到了 EGFR基因的突變，合并KRAS基因突變的檢測，覆蓋率可以達 到70%以上。
[0004] 隨著分子靶向治療在腫瘤治療領域的興起，表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制 劑（EGFR-TKIS)特羅凱、為提高非小細胞肺癌患者生存率和生活質量提供了新的思路， EGFR-TKI通過阻斷信號傳導通路中的表皮生長因子受體酪氨酸激酶區（EGFR Tyrosine Kinase domain，EGFR-TK)達到抑制腫瘤細胞增殖、侵襲、浸潤和血管形成，增加化療藥 物的敏感性，并促進腫瘤細胞凋亡，但遺憾的是并非所有的NSCLC型患者都能從中獲益。 EGFR18、19、21外顯子突變的非小細胞肺癌患者使用表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑 可大大提高患者生存率，而EGFR20外顯子T790M變異和KRAS基因突變的患者會對該藥產 生耐藥性。
[0005] 目前腫瘤相關基因突變檢測方法主要有直接測序法（DNA sequencing)、實時熒光 定量法（qPCR，包括 Scorptions ARMS qPCR、PNA-LNA clamp qPCR 等）、高分辨率熔解曲線 (HRM)、PCR 與質譜（mass spectrometry)及高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC)聯合檢測法等。腫瘤相關基因表達水平的檢測主要依賴于qPCR及 基因芯片技術。直接測序法一直以來被認為是檢測基因突變的金標準，該法費用較低，但操 作耗時長，并且它有兩個明顯的缺點：一是靈敏度低，一般需要突變基因豐度達到20%以 上才能準確檢測。二是由于后續需要對PCR產物進行處理，容易出現污染導致結果不準確。 焚光定量 PCR(Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，FQ-PCR，qPCR) 作為新一代分子生物學研宄工具，已成為分子診斷、臨床檢驗以及基礎生物醫學研宄的主 流技術平臺，廣泛應用于傳染病、腫瘤、遺傳病、心血管等疾病的分子診斷。腫瘤的異質性決 定了腫瘤標本絕大多數為混合標本，通常情況下，微量突變模板與大量野生型模板存在于 同一擴增體系中時，此時大量野生型模板優勢擴增，導致微量突變模板的擴增受到抑制而 檢測不到。因此目前的qPCR和HRM技術最高也只能檢測到1 %的突變體。
[0006] 隨著近年來腫瘤基因組測序方面研宄的發展，人們發現，幾乎所有的癌癥患者的 腫瘤組織中都存在某些體細胞的變異，而這些變異在正常人中檢測不到。有些基因突變不 僅僅可以作為癌癥早期檢測的分子指標，還可以為分子靶向治療提供用藥指導，如EGFR、 EGFR、EGFR 基因等。
[0007] 腫瘤細胞會向血液中釋放基因組DNA，這些變異DNA也隨之釋放到外周血中，被稱 為循環腫瘤DNA (circ μ Lating t μ Mor DNAs)。研宄發現，ctDNAs在早期原位癌（primary cancer)患者血液中就已經開始出現。由于外周血循環DNA的半衰期短，因此循環腫瘤DNA 能夠真實反映患者病變組織基因突變的真實情況。
[0008] 但是，由于外周血循環DNA含量很少，其中腫瘤特異性的突變DNA含量更是少之又 少，尤其是早期癌癥患者，在常規的核酸擴增體系中，微量突變模板與大量野生型模板存在 于同一擴增體系中時，大量野生型模板優勢擴增，導致微量突變模板的擴增受到抑制而檢 測不到。因此在本領域需要一種可以高效快速準確全面地檢測出EGFR基因突變的產品及 方法，以便及時準確地獲得EGFR基因突變的信息。
[0009] 本發明擬涉及一種EGFR基因突變檢測試劑盒及其應用。所述的試劑盒采用新型 位點特異性擴增引物選擇性放大EGFR基因突變DNA，新型封閉探針封阻野生型EGFR基因模 板，進一步提高突變模板選擇性放大的特異性。該試劑盒檢測特異性高，靈敏度高，檢測低 豐度EGFR突變的敏感性可達0.01 %~0. 1%。本檢測試劑盒用于輔助臨床醫生篩選出病 患EGFR基因突變情況，為臨床醫生用藥提供指導和依據。
【發明內容】
[0010] 本發明目的在于提供一種EGFR基因突變檢測試劑盒及其應用，具有快速、準確、 高靈敏的特點。所述的試劑盒采用新型位點特異性擴增引物選擇性放大EGFR基因突變 DNA，新型封閉探針封阻野生型EGFR基因模板，從而進一步提高突變模板選擇性放大的特 異性。其優勢主要體現在將突變檢測敏感度由目前市場上同類試劑盒檢測EGFR基因突變 的1 %提尚到0. 01 %~0. 1 %，檢測特異性尚，靈敏度尚，可應用于除組織標本外的血清、血 漿等標本的非創傷性檢測。
[0011] 本發明提供了一套用于檢測EGFR基因突變的引物、探針及檢測試劑盒，發明相關 內容表述如下：
[0012] EGFR基因突變檢測試劑盒，包含有引物探針的混合液，包含用于EGFR基因突變位 點20條特異性擴增的引物、5條野生序列的高效封阻探針和4條EGFR基因特異性TaqMan 熒光探針。所述的20條特異性擴增的引物為16條上游特異性擴增的引物和4條下游通用 引物。此外，還包括2 XPCR反應液（含DNA聚合酶，dNTP，dUTP，UNG酶，Mg2+等），陽性參 比品、陰性參比品以及無 RNA酶和DNA酶的無菌水。
[0013] 所述的引物包含EGFR基因基因發生在第18、19、20和21號密碼子的29種基因突 變特異中的上游突變引物16條、下游通用引物4條。
[0014] 所述的上游突變引物特征是3'末端為突變堿基。引物的Tm值在45°C~58°C，低 于PCR反應復性溫度3°C~10°C，以提高突變檢測的特異性。
[0015] 上游突變特異性引物：
[0016]
[0017] 所述的下游通用引物為EGFR基因第12、13密碼子下游50~500堿基對范圍內的 一段序列，以及EGFR基因第61密碼子下游50~500堿基對范圍內的一段序列，該序列對 突變沒有選擇性，可擴增所有的EGFR基因。
[0018]
[0019]其中，18R :與 Exl8Fl ~Exl8F3 配對，19R 與 Exl