穩定攜帶綠色熒光蛋白基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆及制備方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物技術領域，更具體涉及一種穩定攜帶綠色熒光蛋白基因的乙型腦炎病毒及制備方法和應用，應用包括在解析腦神經環路、乙型腦炎病毒抗原表位分析和藥物(如抗體藥物)篩選中的應用。
【背景技術】
[0002]人腦是自然界中最為復雜的系統之一，而神經網絡是大腦行使功能的基礎，神經網絡的正常連接，使得機體產生正常的生理活動，如認知、學習、記憶和恐懼等；神經網絡的異常往往導致神經疾病的出現，尚無有效手段來治療這些神經疾病。目前，正常生理活動和致病機制均不清楚，主要的原因在于腦神經網絡連接信息的缺乏。因此，開展腦神經環路的研宄而繪制高精度的腦功能連接圖譜，對于了解人的生理活動和致病機制具有重要的意義。
[0003]乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus，JEV)屬于黃病毒科黃病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長度約為12kb。基因組編碼的多聚蛋白可切割成3個結構蛋白(C、pr M、E)和7個非結構蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)。乙型腦炎病毒具有廣泛的宿主范圍，包括:人、豬、鼠、猴、馬、牛、羊、兔、雞、鴨和鳥類等，能夠進入神經系統而引起腦炎。給人類的健康和農業生產帶來了巨大損失。目前，有預防該病毒感染的疫苗，對于保障人類的健康和提高農業生產的效率發揮了重要作用。但是，目前還沒有有效的藥物來特異的治療該病毒感染引起的疾病。另外，乙型腦炎病毒感染腦神經系統的特性使其成為具備解析神經環路的能力。但是目前尚無能夠穩定攜帶綠色熒光蛋白基因的JEV。而本發明通過一系列的遺傳學篩選及反向的多途徑分析，獲得了能夠穩定攜帶綠色熒光蛋白基因的重組JEV。
[0004]隨著分子生物學的不斷發展，科學家已經能夠通過反向遺傳學的手段來定向改造病毒，為深入開展相關的病毒學研宄提供了良好的工具。因此，本發明分別采用不同的技術途徑獲得了具有穩定表達綠色熒光蛋白的乙型腦炎病毒全長感染性克隆。將在神經環路標記、抗原表位分析、藥物篩選平臺的建立、藥物抑制乙型腦炎病毒作用機制的分析、乙型腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值和前景。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供了一種穩定攜帶綠色焚光蛋白(Enhanced GreenFluorescent Pr otein，EGFP)基因的乙型腦炎病毒(Japanese Encephalitis virus, JEV)全長感染性克隆，其序列為SEQ ID N0:17所示。
[0006]本發明的目的在于提供了一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的制備方法，方法簡單，易行。
[0007]本發明的目的在于提供了一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆應用，該全長感染性克隆可應用于腦科學研宄和藥物篩選和抗原表位分析，也在藥物抑制乙型腦炎病毒作用機制的分析、乙型腦炎病毒疫苗和診斷試劑的研發、動物模型的建立和病毒復制與致病機制的分析等方面具有廣泛的應用價值。
[0008]為了實現以上目的，本發明采用如下技術方案:
[0009]穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆，其構建方法如下:
[0010](I)構建穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆:
[0011]以攜帶有EGFP的JEV全長感染性克隆質粒pJEFL_EGFP為模板(序列為SEQ IDNO: 10)，使用 SEQ ID NO: 12 和 SEQ ID NO: 13 所示引物擴增片段 SEQ ID NO: 11;使用 SEQID NO: 15和SEQ ID NO: 16所示引物擴增片段SEQ ID NO: 14 ;按常規方式檢測回收擴增出的DNA片段。
[0012]使用XhoI+SacI酶切，然后采用Vazyme同源重組試劑盒將SEQ ID NO: 11和SEQID NO: 14片段插入到PJEFL-EGFP，將重組產物轉化感受態HB101，PCR鑒定為陽性的克隆進行培養并抽提質粒進行測序，測序正確的克隆命名為PJEFL-EGFP-N15K，其序列為SEQ IDNO: 17所示。
[0013]穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的應用，包括以下應用:
[0014](I)穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆(pJEFL-EGFP-N15K)制備病毒的能力:
[0015]用KpnI酶切pJEFL-EGFP-N15K，回收被酶切的產物，使用MEGAscript T7Transcript1n Kit分別體外轉錄酶切后的pJEFL-EGFP成為RNA，并轉染BHK21細胞，37°C，5% (v/v)CO2培養箱中培養，并同時設置未轉染RNA的細胞作為對照組，通過Olympus倒置熒光顯微鏡觀察實驗組和對照組的細胞狀態和熒光表達情況。本發明的全長感染性克隆成功制備穩定表達EGFP的重組JEV。。
[0016](2)pJEFL-EGFP-N15K制備的重組JEV在研宄腦神經環路平臺中的應用:
[0017]取0.3 μ I重組JEV病毒定位注射到鼠嗅球，分別在感染后5天和7.5天后麻醉動物，用0.9% (V/V)生理鹽水灌流，然后用4% (V/V)多聚甲醛固定，取出腦組織浸泡于4%(V/V)多聚甲醛液中，然后將腦組織先置于20% (V/V)蔗糖溶液中I天，然后置于30% (V/V)蔗糖溶液中2天；將腦組織底部切平，置于底座上包埋冰凍Ih后切片；取腦片后使用熒光顯微鏡觀察。
[0018]所述的應用對象不僅限于鼠，還能用于猴、豚鼠、人、大鼠、蝙蝠、豬、馬、牛、羊、兔、雞、鴨和鳥等動物的神經環路標記。
[0019](3)PJEFL-EGFP-N15K制備的重組JEV在分析抗原表位和抗乙型腦炎病毒藥物(抗體藥)篩選中的應用:
[0020]在6孔細胞培養板中接種8Χ105ΒΗΚ21細胞/孔，在37°C，5%卜八)0)2培養條件下，匯合度達到90%時。將50 μ I重組JEVPO代病毒液與50 μ I乙型腦炎病毒的抗體混合，37°C吸附30min，然后將該混合液加入各孔，37°C吸附Ih ;吸附完畢后將各個孔的病毒液吸棄，分別加入用含2% (v/v)胎牛血清的DMEM培養基，于37°C，5% (v/v) CO2的培養箱中培養72h，使用熒光顯微鏡觀察。
[0021]本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果:
[0022]1.本發明制備了穩定表達EGFP的乙型腦炎病毒，其具有可視化的特點，便于開展相關的研宄。目前國內外還沒有用于穩定表達綠色熒光蛋白的重組乙型腦炎病毒，本發明填補了該空白。
[0023]2.本發明對于開展JEV的基礎性研宄(如致病機制、復制機制等)和應用性研宄(如神經環路標記、藥物篩選、抗原表位分析、新型疫苗和診斷試劑等)具有重要的現實意義和廣泛的應用價值；
[0024]3.解析神經環路結構是開展腦科學研宄的基礎，良好用于神經環路標記的工具對于解析神經環路的結構具有重要意義。JEV能夠感染人和鼠等動物的神經細胞，具有作為神經環路標記的潛力。本發明不僅能夠用于鼠等非靈長類動物，而且還能用于非人靈長類動物的腦科學研宄。
【附圖說明】
[0025]圖1為一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的構建示意圖。
[0026]A:一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的構建示意圖；
[0027]B:一種攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒全長感染性克隆的RNA轉染BHK21細胞后的熒光表達情況。
[0028]C:一種攜帶EGFP基因的重組乙型腦炎病毒的產生的plaque形態不穩定；
[0029]D:一種攜帶EGFP基因的重組乙型腦炎病毒的攜帶EGFP在擴增的過程中發生丟失。
[0030]圖2為一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒的篩選示意圖。
[0031]A:篩選流程；
[0032]B:篩選獲得的穩定表達EGFP的重組JEV的plaque形態特征；
[0033]C:篩選的穩定表達EGFP的JEV重組病毒的全基因組測序分析導致穩定攜帶EGFP的原因。
[0034]圖3為一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒產生的細胞病變和表達熒光示意圖。
[0035]A:未感染病毒的細胞；
[0036]B:穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒感染BHK21細胞產生的細胞病變；
[0037]C:穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒感染BHK21細胞表達熒光蛋白。
[0038]圖4為一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒的穩定性檢測
[0039]A:一種穩定攜帶EGFP的JEV重組病毒的產生的plaque形態穩定；
[0040]B:一種穩定攜帶EGFP的JEV重組病毒的在增殖的過程中攜帶的EGFP基因穩定；[0041 ]C:一種穩定攜帶EGFP的JEV重組病毒體外表達EGFP的檢測；
[0042]D:一種穩定攜帶EGFP的JEV重組病毒體內穩定表達EGFP的檢測。
[0043]圖5為一種穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒解析鼠腦神經環路的示意圖。
[0044]A:在感染后5天穩定攜帶EGFP基因的乙型腦炎病毒標記鼠VPM和皮層區