一種柔嫩艾美爾球蟲tert相關蛋白基因及醫用用圖
【技術領域】
[0001] 本發明提供了一種柔嫩艾美爾球蟲TERT相關蛋白基因，特別涉及該蛋白在端粒 酶活性調節中的作用，該蛋白對于凡端粒酶活性具有負向調節的作用，可能成為 控制球蟲病的潛在靶點，屬于基因工程技術領域。
【背景技術】
[0002] 雞球蟲病是一種呈世界性分布，嚴重危害養雞業發展的寄生蟲病。艾美耳球蟲作 為細胞內寄生蟲，寄生于雞腸道內引起是由以腸道病變為主要特征的雞球蟲病并嚴重危害 養禽業的發展。目前控制球蟲病還是主要依賴抗球蟲藥和疫苗的使用，但由于對球蟲的細 胞和分子生物學等缺乏詳盡的了解，迄今尚無理想的控制雞球蟲病的藥物和疫苗。因此，尋 找新的藥物和疫苗靶位防治雞球蟲病成為當前研宄的主流。端粒酶及相關蛋白的發現為深 入研宄球蟲的細胞和分子生物學特性以及尋找新的防治雞球蟲的藥物和疫苗作用靶位等 開辟了新的研宄領域。目前，柔嫩艾美爾球蟲（萬.imdh) TERT序列已經成功克隆出來， 而端粒-like序列已被預測出來。這些表明萬.利用傳統的端粒酶機制合成其端 粒DNA維持染色體末端的穩定。但關于萬.TERT相關蛋白及功能尚未見報道。
【發明內容】
[0003] 本發明提供了一種柔嫩艾美爾球蟲TERT相關蛋白基因，為一種萬.TERT 互作蛋白14-3-3基因，該基因編碼的蛋白對于凡端粒酶活性具有負向調節的作 用，可能成為控制球蟲病的潛在靶點，為球蟲病的防治提出新的策略。
[0004] 本發明所述的一種柔嫩艾美爾球蟲TERT相關蛋白基因，如SEQ ID NO 1、SEQ ID NO 2所示。
[0005] 該基因編碼的蛋白是利用酵母雙雜交的方法通過TERT蛋白對萬.的cDNA 文庫進行篩選，獲得與TERT有相互作用的蛋白，并通過pull-down的方法進行陽性驗證，從 而篩選得到與TERT蛋白相互作用的萬.蛋白基因。利用萬.病毒載體介 導的核酶干擾互作蛋白基因在球蟲體內的表達，從而研宄該基因編碼的蛋白在萬. 體內的功能。
[0006] 本發明所述的一種柔嫩艾美爾球蟲TERT相關蛋白基因的制備方法，包括以下步 驟： (1) TERT片段的克隆和鑒定：從萬.cDNA中通過PCR獲得TERT序列，與 PMD18-T連接后轉化至宿主菌中克隆擴增，再通過雙酶切及序列測定分析鑒定目的片段； (2) 含有外源目的片段的重組誘餌質粒的構建：回收目的片段，與酶切后的pGBKT7載 體連接，并轉入大腸桿菌中，篩選陽性克隆，即得到可表達融合蛋白的重組質粒； (3) 將重組誘餌質粒轉化入酵母菌株，并進行表達產物、毒性及自激活鑒定； (4) 用酵母雙雜交的方法篩選萬.cDNA文庫中與TRBD相互作用的候選蛋白； (5) 用pull-down的方法進一步驗證陽性互作蛋白，從而篩選得到與萬.TERT 相互作用的蛋白。將TERT基因和候選蛋白基因分別構建到pET-32a和pGEX-4T-l載體上， 在BL21(DE3)感受態中誘導表達并純化可溶性蛋白。將純化的兩種蛋白共孵育，并加入蛋 白A磁珠沉淀，最后通過Western blot分析陽性互作的結果； (6) 設計合成針對互作蛋白基因的的錘頭狀核酶并連接到萬.病毒載體上，對 該基因切割效率進行體內和體外試驗； (7) TRAP法檢測轉染株端粒酶活性。
[0007] 本發明的積極效果在于： 提供一種萬.TERT互作蛋白基因，并進行其功能的研宄，為深入研宄球蟲的細 胞和分子生物學特性以及尋找新的防治雞球蟲的藥物和疫苗作用靶位等開辟了新的研宄 領域。本發明具有高效性及實用性的優點，通過酵母雙雜交篩選和驗證可以獲得多個陽性 互作蛋白，便于發現新功能蛋白，并且該方法相對于比較分析法、蛋白組學、轉錄組學等技 術更為成熟和益于操作。凡病毒轉染載體介導核酶為研宄基因在蟲體內的功能提 供了一種簡單易行的方法。
【附圖說明】
[0008] 附圖1為pGBKT7-TRBD雙酶切鑒定電泳圖； 附圖2為Western blot鑒定重組pGBKT7-TRBD蛋白在Y187中的表達； 附圖3為重組誘餌蛋白對酵母菌毒性及自激活作用的檢測； 附圖4為α -半乳糖苷酶試驗檢測TRBD與候選蛋白相互作用； 附圖5為SDS-PAGE鑒定His-TRBD和GST-14-3-3純化效果圖； 附圖6為pull-down驗證TRBD與14-3-3間相互作用； 附圖7為凡病毒載體介導的錘頭狀核酶體外切割效率檢測中重組質粒模式 圖； 附圖8為建立的14-3-3-sub標準曲線。
[0009] 附圖9為凡病毒載體介導的錘頭狀核酶對14-3-3-sub體外切割效果檢 測； 附圖10為RFP在凡中的表達情況； 附圖11為流式細胞術檢測和分選RFP-Ham-14-3-3株； 附圖12為Western blot鑒定各蟲株14-3-3表達水平變化； 附圖13為TRAP檢測各蟲株中端粒酶活性的變化。
【具體實施方式】
[0010] 為進一步說明本發明在艾美耳屬球蟲TERT相關蛋白中的應用，以TERT RNA結合 域（TRBD)為實施例進行說明。
[0011] 實施例1: 萬.TRBD誘餌表達質粒的構建 一、材料 Trizol (Invitrogen);反轉錄酶試劑盒（Tiangen) ;T4 DNA 連接酶、Ex Taq、dNTPs、 pMD18~T> i?coR I s BaiM I (TaKaRa)0
[0012] 二、方法與結果 1五孢子化卵囊總RNA提取 1.1器皿的處理：將研缽、研杵洗滌干凈后，浸泡在0.1% DEPC-H2O中過夜。隨后用錫 紙包好，180°C干烤3h備用； 1.2收集的凡孢子化卵囊液氮研磨20min，加入ImL Trizol，室溫裂解5min; L 3加入20〇μL氯仿，混勻，室溫放置15min，12000g、4°C離心15min ; I. 4吸取上層約60〇μL RNA轉移至新的離心管，加入50〇μL異丙醇，混勻，室溫放置 15min，12000區、4。。離心 15min ; 1. 5去上清，沉淀用75%乙醇洗滌，12000g，4°C離心15min ; 1. 6去上清，離心管放入超凈臺內風干5min。RNase-free ddH20溶解沉淀。瓊脂糖凝 膠電泳檢測總RNA的質量，顯示總RNA提取的質量較好。
[0013] 2 E. cDNA 的合成 1〇μL RNA和2PL Oligo (dT) 15混勻，65°C水浴5min，隨后置于冰上2min。加入下列混 合物：
42°C水浴lh，75°C IOmin滅活反轉錄酶。
[0014] 3 pGBKT7-TRBD 質粒的構建 3.1 PCR擴增目的基因：根據目的基因設計特異引物，并在上下游引物中分別添加了 feoR I 和 I 酶切位點。F-TRBD-BK 5'-G^7TiATTACAAGTACTAGAGTAGTAAATT-3'（斜 體為 feoR I 酶切位點），下游 R-TRBD-BK 5'-6^7TCTCCTTTTAAACTTTCTAGATAC-3'（斜體 為ifeMl I酶切位點)。引物由上海生物工程技術服務公司合成。
[0015] 以cDNA為模板，進行PCR，PCR體系如下：
反應參數為：95°C 5min;94°C 45sec，55°C 30sec，72°C 30sec，30 cycles;72°C IOmin0
[0016] 3. 2目的片段與pMD18-T連接：回收的PCR產物與pMD18-T載體連接，4°C過夜，連 接反應體系如下：
3. 3重組克隆質粒的酶切鑒定：將1〇μL連接產物加入DH5a感受態中，取100μL菌液 均勻涂布于含Amp+的LB固體培養基上。從LB固體平板上挑取單個克隆置于含50 μ g/mL Amp+的LB液體培養基中，過夜培養。經序列測定獲得陽性重組質粒。
[0017] 3. 4重組誘餌質粒pGBKT7-TRBD的構建 測序正確的克隆質粒以及載體PGBKT7分別經及洲I/feoR I雙酶切后凝膠回收。回 收的目的片段和載體片段4°C連接過夜后轉化DH5a感受態細胞。經雙酶切和序列測定獲得 陽性重組誘餌質粒(見附圖1)。連接體系如下：
[0018] 實施例2: 重組誘餌蛋白對酵母菌株毒性及自激活作用的檢測 一、材料 X-a -GAL、鞋魚精 DNA (Sigma);酵母氮源（Biosharp) ;c_Myc (Epitomics) ;ECL 化學 發光試劑盒（Thermo );酵母質粒小提試劑盒（Tiangen )。
[0019] 二、方法與結果 I Y187酵母感受態的制備及重組誘餌質粒PGBKT7-TRBD的轉化 I. 1將凍存的Y187細胞平板劃線，30°C溫箱培養3~4d至長出直徑2~3mm的單克隆； 1.2挑取Y187酵母單克隆細胞，接入含IOmL YPDA液體培養基的50mL錐形瓶中，并吹 打均勻，30° C，210r/min震蕩培養至0D_>1. 5 ;取4~5mL酵母菌接入50mL YPDA液體培養 基中，30° C，210r/min 振蕩培養至 0D_=0. 4~0· 6 ; 1.3 50mL離心管收集酵母菌液，700g室溫離心5min，棄上清；加入25~50mL ddH20重懸 洗滌酵母沉淀細胞，700g離心5min，去上清，重復洗滌一次；用1.5mL ΙΧΤΕ/LiAc (10XTE 150uL，10XLiAc 150uL，ddH20 1.20mL)重懸沉淀，重懸液即為酵母感受態細胞； 1. 4轉化質粒與鮭魚精DNA置于I. 5mL離心管中，混勻；
[0020] 新鮮配制的鮭精DNA需要水浴煮沸20min并且冰浴后使用; ' 1. 5每管加入IOOuL酵母感受態細胞，振蕩混勻； 1.6 各加入 600uL PEG/LiAc(10XTE 60uL，10XLiAc 60uL，50%PEG 480uL)，為了提高 轉化效率，混合物需劇烈震蕩，30° C，210r/min振蕩培養30min ; 1. 7加入70uL DMS0,緩慢倒置混勻（不能振蕩），42° C水浴15min，迅速插入冰浴冷 去|] l~2min ; 1.8 室溫離心 12