抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列及其 應用。
【背景技術】
[0002] 肌肉生長抑制素（Myostain，MSTN)，又稱生長因子-8(⑶F-8)，屬轉化生長因 子-(TGF-)超家族，發現于1997年，是一種骨骼肌生長發育的負調控因子。其活性的喪失 或降低會引起肌肉的過度增長，導致雙肌性狀。鴨MSTN基因含有375個氨基酸，其功能和 表達量的變化可能會通過調節生肌因子（MRF)等基因的表達而調節肌肉的生長發育。該基 因的表達抑制有助于研宄該基因的功能。
[0003] RNA干擾（RNAinterference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的，由雙鏈 RNA (double-stranded RNA，dsRNA)誘發的，同源mRNA高效特異性降解的現象。由于使用 RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能 和傳染性疾病及惡性腫瘤的基因治療領域。短發卡RNA(short hairpin RNA，shRNA)是可 以克隆到表達載體并表達短的干擾RNA (siRNA，19-21個核苷酸的RNA雙鏈）的DNA分子， 包括兩個短反向重復序列，中間由一莖環（loop)序列分隔的，由polIII啟動子控制，隨后 再連上5-6個T作為RNA聚合酶III的轉錄終止子。通過載體將"短干涉RNA"輸送入細胞 或活體組織中，被細胞機制切割成siRNA，由SiRNA發揮作用達到沉默靶基因表達的作用。
[0004] 目前，缺乏一種有效抑制鴨MSTN基因表達的ShRNA的序列及其應用。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是為了提供一種抑制鴨MSTN基因表達的ShRNA的序列及其應用。
[0006] 本發明的一種抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列，所述shRNA序列選自下列核苷 酸序列中的一種：
[0007] (1)如 SEQ ID NO. 1-2 所示的 DNA 序列；
[0008] (2)如 SEQ ID NO. 3-4 所示的 DNA 序列；
[0009] (3)如 SEQ ID NO. 5-6 所示的 DNA 序列。
[0010] 一種包含抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列的重組表達載體。
[0011] 所述重組表達載體是基于PLL3. 7載體構建的載體。
[0012] 所述重組表達載體用于促進鴨成肌細胞的增殖。
[0013] 所述shRNA序列用于促進鴨成肌細胞的增殖。
[0014] 本發明的有益效果為：首次報道了抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列。上述三種 抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列均可明顯抑制鴨成肌細胞中MSTN基因在mRNA水平的 表達，并且，通過抑制鴨成肌細胞中MSTN的表達促進了鴨成肌細胞的增殖，上調生肌調節 因子Myf5基因的表達，下調生肌調節因子MyoDl基因的表達。本發明所述的鴨MSTN基因 的三種shRNA序列均能有效抑制鴨成肌細胞中MSTN基因的表達，在基因水平的抑制效率分 別達到了 61. 6%、79· I %和 76. 9%。
【附圖說明】
[0015] 圖1是本發明抑制鴨MSTN基因表達的shRNA序列重組慢病毒侵染鴨成肌細胞的 侵染效率照片；
[0016] 圖2是本發明shRNA序列重組慢病毒對鴨成肌細胞中MSTN基因表達的抑制效果 圖；
[0017] 圖3是本發明shRNA序列重組慢病毒影響鴨成肌細胞的增殖結果圖；
[0018] 圖4是本發明shRNA序列重組慢病毒影響鴨成肌細胞中生肌因子表達結果圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合附圖和實施例對本發明進行詳細地解釋說明。
[0020] 實施例1
[0021] shRNA序列的設計和合成：
[0022] (1)通過 GenBank 數據庫（http://www. ncbi. nlm. nih. gov/genbank)查詢鴨 MSTN 基因的mRNA信息，根據shRNA設計原則，設計了針對鴨MSTN基因的MSTN-shRNA序列，同時 設計了 1條無關的對照shRNA序列，作為對照組（control)。上述設計完成的shRNA序列 交由中美泰和生物技術有限公司合成。3條shRNA分別靶向鴨MSTN基因（EU336991.1)的 318位點、767位點以及1096位點，長為21個堿基。
[0023] 其中，本發明所涉及的MSTN-shRNA-318的作用位點序列為：
[0024] 5' -GGAAGACGATGACTATCATGC-3'
[0025] MSTN-shRNA-767的作用位點序列為：
[0026] 5' -GAGTTACAGACACACCGAAAC-3'
[0027] MSTN-shRNA-1096的作用位點序列為：
[0028] 5, -GCCATGGTTGTAGATCGTTGC-3'
[0029] 對照 shRNA 序列（Control-shRNA)為：
[0030] 5' -GATGGATCGATAGGTAACGGAG-3，
[0031] 針對上述3種shRNA及Control-shRNA的作用位點序列設計合成相應的shRNA正 義鏈與反義鏈DNA序列：
[0032] MSTN-shRNA-318 正義鏈：
[0033] 5' -GGAAGACGATGACTATCATGCtcaagagGCATGATAGTCATCGTCTTCCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 1)
[0034] MSTN-shRNA-318 反義鏈：
[0035] 5'-tcgagAAAAAGGAAGACGATGACTATCATGCctcttgaGCATGATAGTCATCGTCTTCC-3' （SEQ ID NO. 2)
[0036] MSTN-shRNA-767 正義鏈：
[0037] 5' -GAGTTACAGACACACCGAAACtcaagagGTTTCGGTGTGTCTGTAACTCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 3)
[0038] MSTN-shRNA-767 反義鏈：
[0039] 5'-tcgagAAAAAGAGTTACAGACACACCGAAACctcttgaGTTTCGGTGTGTCTGTAACTC-3' （SEQ ID NO. 4)
[0040] MSTN-shRNA-1096 正義鏈：
[0041] 5, -GCCATGGTTGTAGATCGTTGCtcaagagGCAACGATCTACAACCATGGCTTTTTc-3, （SEQ ID NO. 5)
[0042] MSTN-shRNA-1096 反義鏈：
[0043] 5'-tcgagAAAAAGCCATGGTTGTAGATCGTTGCctcttgaGCAACGATCTACAACCATGGC-3' （SEQ ID NO. 6)
[0044] Control-shRNA 正義鏈：
[0045] 5' -GATGGATCGATAGGTAACGGAGcgaaCTCCGTTACCTATCGATCCATCTTTTTc-3' （SEQ ID NO. 7)
[0046] Control-shRNA 反義鏈：
[0047] 5' -tcgagAAAAAGATGGATCGATAGGTAACGGAGttcgCTCCGTTACCTATCGATCCATC-3' （SEQ ID NO. 8)
[0048] 上述正義鏈模板的3'端添加了 c，反義鏈模板的5'端均添加了 tcgag，與XholI 形成粘端互補。
[0049] (2)將等量的正義鏈（100μΜ，2μ1)和反義鏈（100μΜ，2μ1)?ΝΑ混合，加入 IOXshDNA Annealing Buffer (2 μ 1)，再加雙蒸水 14 μ 1，總體積 20 μ 1。在 PCR 儀上按照 如下程序進行退火處理：95°C 5min ;72°C IOmin ;放室溫60min。退火處理后獲得10 μΜ的 shRNA模板。取5 μ 1模板加水95 μ 1作為退火產物工作濃度用，工作濃度為500ηΜ。
[0050] (3)將PLL3. 7載體進行Hpal和Xhol雙酶切，進行載體的線性化處理，酶切條件 如下所述：取1〇μ1的PLL3. 7載體，ΙμL的HpalI內切酶、ΙμL的XholI內切酶、6μ1的 lOXbuffer，CldH2O 42 μ 1，總體積60 μ 1，與37°C酶切3h，回收純化后做連接反應。
[0051] (4)將線性化的PLL3. 7載體3 μ 1、經退火處理的shRNA模板2 μ I (500nM)，T4連接 酶1 μ 1、10 X T4連接緩沖液1 μ 1，雙蒸水3 μ 1，共10 μ 1，混勾，于22°C連接過夜。取10 μ 1 連接產物轉化大腸桿菌ToplO感受態細胞，將細胞均勾涂布于含50 μ g/ml Ampicillin 的LB培養基平板上，平板倒置于37°C培養箱中，培養16小時。從每塊平板上分別挑取5 個菌落，接種到含50 μ g/ml Ampicillin的LB培養基中，37°C培養16小時。使用堿裂解 法提取質粒，所得質粒用Xhol進行單酶切鑒定，同時進行測序鑒定后大量制備重組質粒 PLL3. 7-MSTN-shRNA。
[0052] (5)將重組載體 PLL3. 7-MSTN-shRNA-318、PLL3. 7-MSTN-shRNA-767、 PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096 和 PLL3. 7-Control-shRNA 分別與含 VSV-g 的 PMD2. G 及含 gag/ pol的psPAX2包裝質粒在生理鹽水中混合，并加入轉染試劑Fitran，孵化20min后緩慢均 勻滴入含293T細胞的培養皿中。放置37°C、5% CO2、飽和濕度培養箱中過夜培養。轉染4-6 小時后換液，分別在轉染48h和72h收集上清，3000rpm 4°C離心10min，取上清用0. 45 μ m 微孔濾器過濾。給慢病毒上清鋪上20 %蔗糖墊50000g超高速離心濃縮2h，用PBS重溶慢 病毒顆粒。
[0053] 實施例2
[0054] 重組慢病毒感染鴨成肌細胞：
[0055] 將上述3種shRNA重組慢病毒和Control-shRNA的慢病毒顆粒轉染鴨原代成肌細 胞，利用熒光顯微鏡技術檢測不同shRNA的感染效率。
[0056] (1)實驗分組：實驗分 PLL3. 7-Control-shRNA 對照組（Control)、 PLL3.7-MSTN-shRNA-318 感染組、PLL3.7-MSTN-shRNA-767 感染組、 PLL3. 7-MSTN-shRNA-1096感染組，共4組，所有組的細胞數量和培養條件均