一種向日葵白銹病菌和黑莖病菌的多重dpo-pcr檢測試劑盒及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種向日葵白銹病菌和黑莖病菌的多重 DPO-PCR檢測試劑盒及其應用。
【背景技術】
[0002] 向日葵白銹病菌（Albugo tragopogonis(Pers. )Gray)是引起向日葵白銹病的病 原菌，該病菌在國外少數國家和地區嚴重發生、經濟影響大、傳入風險高，成為國際上關注 的檢疫性有害生物。向日葵黑莖病菌（Leptosphaeria lindquistii Frezzi)是引起向日 葵黑莖病的病菌，嚴重的病田發病率達100 %，對向日葵生產造成毀滅性危害，是一種重要 的檢疫性病原菌。因此，對這兩種病原菌進行準確的檢疫鑒定非常重要，而傳統形態學方法 鑒定周期長、時效性差。利用血清學和分子生物學技術鑒定這兩種菌的方法已有建立，包括 PCR、RFLP等，但這些方法有些需要酶切，檢測過程復雜；有些特異性不強或依賴較昂貴的 儀器設備，難以在實驗室之間推廣。因此，建立一種特異性強、且能同時快速檢測這兩種菌 的檢測方法顯得非常重要。
[0003] DPO(Dual priming oligonucleotide)引物技術的主要原理為其引物包含兩個各 自獨立的特異性引物區域，5'端序列由18-25個堿基組成并與靶基因序列配對，3'端序 列由6-12個堿基用來引導PCR反應的特異性延伸，這兩段獨立的特異性區域利用寡聚次黃 嘌呤（In 〇Sine，I)進行連接，由于次黃嘌呤比一般堿基的退火溫度低，在退火時寡聚次黃 嘌呤形成類似泡狀的結構，從而使5'和3'區域形兩個獨立功能的雙特異性引物結構，并 且研宄表明5'和3'引物區域中任何有3個及以上堿基的錯配，PCR反應將不能進行，而 且由于其特殊的結構，引物自身以及引物之間很少形成二級結構且對退火溫度不敏感。該 技術的優點主要在于它對退火溫度、鎂離子濃度等影響普通多重PCR的關鍵因素不敏感， 適用范圍廣，而且該技術特異性強，擴增效率高，為多重PCR技術的應用提供了新的前景。
【發明內容】
[0004] 本發明要解決的技術問題是如何檢測待測菌株是向日葵白銹病菌和向日葵黑莖 病菌。
[0005] 為解決上述技術問題，本發明提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白銹 病菌還是向日葵黑莖病菌的引物組。
[0006] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白銹病菌還是向日葵黑莖病菌 的引物組由引物1、引物2、引物3和引物4組成：
[0007] 所述引物1為SEQ ID No. 1所示的單鏈DNA分子；
[0008] 所述引物2為SEQ ID No. 2所示的單鏈DNA分子；
[0009] 所述引物3為SEQ ID No. 3所示的單鏈DNA分子；
[0010] 所述引物4為SEQ ID No. 4所示的單鏈DNA分子。
[0011] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白 銹病菌還是向日葵黑莖病菌的PCR試劑。
[0012] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白銹病菌還是向日葵黑莖病菌 的PCR試劑包括上述引物組。
[0013] 上述PCR試劑中，所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4在所述PCR試 劑中的終濃度均為〇· 4 ymol/Lo
[0014] 為解決上述技術問題，本發明還提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白 銹病菌還是向日葵黑莖病菌的試劑盒。
[0015] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白銹病菌還是向日葵黑莖病菌 的試劑盒包括上述引物組或上述PCR試劑。
[0016] 上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵 白銹病菌還是向日葵黑莖病菌中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0017] 上述引物組或上述PCR試劑或上述試劑盒在區分或輔助區分向日葵白銹病菌和 向日葵黑莖病菌中的應用也屬于本發明的保護范圍。
[0018] 為解決上述技術問題，本發明最后提供了一種檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵 白銹病菌還是向日葵黑莖病菌的方法。
[0019] 本發明提供的檢測或輔助檢測待測菌株是向日葵白銹病菌還是向日葵黑莖病菌 的方法包括如下步驟：
[0020] (1)用上述引物組對待測菌株進行PCR擴增，得到PCR擴增產物；
[0021] (2)檢測所述PCR擴增產物的大小；
[0022] 若所述PCR擴增產物含有大小為307bp的片段，則待測菌株為或候選為向日葵白 銹病菌；
[0023] 若所述PCR擴增產物含有大小為388bp的片段，則待測菌株為或候選為向日葵黑 莖病菌
[0024] 上述方法中，所述PCR擴增的模板為待測菌株的基因組DNA。
[0025] 上述方法中，所述PCR擴增為多重DP0-PCR。
[0026] 上述方法中，所述PCR擴增的退火溫度為45-65°C。
[0027] 上述方法中，所述PCR擴增的退火溫度為60°C。
[0028] 上述方法在檢測或輔助檢測向日葵白銹病和/或向日葵黑莖病的病菌中的應用 也屬于本發明的保護范圍。
[0029] 本發明根據向日葵白銹病菌大亞基核糖體RNA基因序列和向日葵黑莖病菌的 ITS-5.8S rRNA基因序列，設計了特異性DPO引物，并基于該引物建立了向日葵白銹病菌和 向日葵黑莖病菌的多重DPO-PCR檢測方法，可同時對向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌進 行定性檢測。通過實驗證明：本發明的多重DPO-PCR方法特異性好，靈敏度高，而且對退火 溫度不敏感，適用范圍廣，基于多重DPO-PCR方法對向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌進 行定性檢測方法靈敏、準確、簡便和快速，對進出口相關貨物及產品檢驗檢疫、病害防治預 測具有指導意義。
【附圖說明】
[0030] 圖1為多重DPO-PCR擴增產物的電泳檢測結果。其中，I :向日葵黑莖病菌和向日 葵白銹病菌；2 :向日葵黑莖病菌；3 :向日葵白銹病菌；4 :陰性對照。
[0031] 圖2為特異性實驗的電泳檢測結果。其中，1 :向日葵黑莖病菌和向日葵白銹病菌； 2 :向日葵黑莖病菌；3 :向日葵白銹病菌；4 :向日葵黑白輪枝菌；5 :向日葵大麗輪枝菌；6 : 向日葵莖潰瘍病菌；7 :向日葵霜霉病菌；8 :向日葵菌核病菌；9 :向日葵褐斑病菌；10 :向日 葵銹病菌；11 :陰性對照。
[0032] 圖3為退火溫度敏感實驗的電泳檢測結果。其中，1-5 :退火溫度分別為45°C、 50°C、55°C、60°C和 65°C。
[0033] 圖4為靈敏度實驗的電泳檢測結果。其中，1-5 :2種病原菌DNA模板量依次為 50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng 和 0· 005ng。
【具體實施方式】
[0034] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0035] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0036] 下述實施例中的向日葵白銹病菌（Albugo tragopogonis(Pers. )Gray)在文獻"向 日葵白銹病菌巢式PCR檢測方法的研宄"中公開過，公眾可從伊犁出入境檢驗檢疫局獲得。
[0037] 下述實施例中的向日葵黑莖病菌（Leptosphaeria lindquistii Frezzi)在文獻 "向日葵黑莖病菌分離檢測及其RFLP分析"中公開過，公眾可從伊犁出入境檢驗檢疫局獲 得。
[0038] 實施例1、一種檢測向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌的方法
[0039] 一、多重DPO-PCR引物組的設計
[0040] 根據向日葵白銹病菌大亞基核糖體RNA基因序列和向日葵黑莖病菌的 ITS-5. 8SrRNA基因序列，設計了如下檢測向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌的多重 DPO-PCR檢測引物組（引物序列中的I為次黃嘌呤）：
[0041] BS-DPO-F :CGAATTGTAGTCTATCGAGGCCAAGIIIIIACGCAGGATCC(序列 1);
[0042] BS-DPO-R :GGAATGGACAGCGGACGCIIIIIGCTTCCCT(序列 2);
[0043] HJ-DPO-F :GATGCCGGTACTCTGGGTCTTTIIIIICATGTACC(序列 3);
[0044] HJ-DPO-R :ATTGTTTTGAGGCGAGTTTCCCIIIIIGGAAACAT(序列 4);
[0045] 其中，BS-DPO-F和BS-DPO-R為檢測向日葵白銹病菌的引物，產物大小為307bp ; HJ-DPO-F和HJ-DPO-R為檢測向日葵黑莖病菌的引物，產物大小為388bp。
[0046] 二、檢測向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌的方法
[0047] UDNA 的提取
[0048] 參照試劑盒操作（植物基因組DNA提取試劑盒，貨號為DP305-02,天根生物科技有 限公司）分別提取向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌的基因組DNA。
[0049] 2、多重 DPO-PCR 擴增
[0050] 采用 BS-DPO-F、BS-DPO-R、HJ-DPO-F、HJ-DPO-R 共 4 條多重 DPO-PCR 引物，分別以 如下四組的基因組DNA為模板進行多重DPO-PCR擴增，分別得到多重DPO-PCR擴增產物：
[0051] 組1以向日葵白銹病菌和向日葵黑莖病菌的基因組DNA(向日葵白銹病菌和向日 葵黑莖病菌各1 μ L)為模板；
[0052] 組2以向日葵黑莖病菌的基因組DNA為模板；
[0053] 組3以向日葵白銹病菌的基因組DNA為模板；
[0054] 組4以超純水為DNA模板（陰性對照）。