基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小片段DNA文庫的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及醫學分子生物學領域，具體涉及一種基于Illumina Hiseq 2500測序 平臺的小片段DNA文庫的構建方法。
【背景技術】
[0002] 染色體非整倍體是指相對于人的正常的46條染色體而言，細胞中的某一條或幾 條染色體數目增加或減少，與嬰幼兒期顯著的發病率和死亡率有著密切的關系。新生兒中 染色體異常的發病率為1/160,其中21-三體（唐氏綜合征）、18-三體（愛德華氏綜合征） 和13-三體（帕陶氏綜合征）是三種最主要常染色體非整倍體疾病，在新生兒中發病率分 別為1/800、1/6000和1/1000。目前此類疾病尚無有效治療方法，正能通過產前診斷減少患 兒的出生。
[0003] 在該類疾病現有的檢測方法中，利用第二代高通量測序技術對胎兒染色體非整 倍體進行檢測的方法具有明顯的優勢。第一，只需抽取母體外周血進行檢測，避免了傳統 的侵入性方法可能會對孕婦和胎兒帶來的危害；第二，直接檢測染色體上的DNA序列即直 接致病因素，與用血清蛋白標記物和超聲波進行檢測的方法相比，檢測的準確性和靈敏度 都大大提高；第三，通過深度測序，實現了對孕婦外周血中少量胎兒游離DNA(cell-free fetalDNA, cffDNA)的準確檢測，克服了傳統檢測方法因胎兒游離DNA的含量過低而呈現搞 得假陰性率的缺點。
[0004] 高通量測序技術又稱為下一代測序技術、以能一次并行對幾十萬到幾百萬條DNA 分子進行序列測定和讀長較短等為標志。第二代高通量illumina測序平臺具有測序通量 高、準確度高和成本低等優點，并廣泛應用于多個領域。在高通量檢測方法的整個流程中， 游離DNA文庫的制備是非常關鍵的一步，文庫質量的好壞將直接影響測序數據的質量，并 影響檢測結果的準確性。
[0005] 現有技術中基于Illumina Hiseq2500測序平臺的文庫構建方法主要包括以下步 驟：
[0006] 1、將DNA打斷到一定的大小并純化；
[0007] 2、對DNA片段進行末端修復并純化；
[0008] 3、在已修復的DNA片段的3'端加上一個"A"堿基并純化；
[0009] 4、用DNA連接酶將特異性接頭連接至DNA片段的兩端，純化；
[0010] 5、對加接頭的DNA序列進行瓊脂糖凝膠電泳，切膠回收一定大小的片段，純化； [0011] 6、采用PCR方法擴增DNA文庫，純化。
[0012] 用Agilent Bioanalyzer2100和Q-PCR檢測上述構建文庫的片段大小及濃度，之 后使用Illumina測序平臺進行高通量測序。上述基于illumina測序平臺的文庫構建方法 存在自身的局限性：第一，上述小片段DNA文庫構建流程繁瑣，操作過程復雜，建庫所花費 的時間長；第二，上述建庫流程中，各個步驟需相互獨立進行制備且都需要進行純化，這就 造成了 DNA文庫樣品不可避免的損失和浪費，不適用于DNA量少的樣本或其他珍惜樣本的 檢測；第三構建文庫所用試劑的種類繁多，使得整個構建文庫的過程的成本增加。
【發明內容】
[0013] 本發明目的是提供一種基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小片段DNA文庫的 構建方法，以降低建庫成本和縮短建庫時間。
[0014] 本發明采用以下技術方案：
[0015] 本發明第一方面提供了一種基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小片段DNA文 庫的構建方法，包括如下步驟：
[0016] (1)血液游離DNA提取：采用磁珠法從樣品中提取血液游離DNA ;
[0017] (2)片段大小篩選：利用磁珠對步驟（I)DNA進行片段大小篩選及純化；
[0018] (3)末端修復：將步驟⑵得到的DNA與試劑1混合，在PCR儀上按22°C 20min， 72°C 20min的程序進行孵育反應；
[0019] (4)3,端添加接頭：將步驟（3)所得的反應體系與試劑2混合，在PCR儀上 22°C 15min，72°C 20min的程序進行孵育反應；之后磁珠純化；
[0020] (5) PCR擴增：將步驟（4)得到的DNA片段加入試劑3進行PCR擴增；
[0021] (6)磁珠純化：將步驟（5)所得擴增產物利用磁珠進行純化，得到小片段的DNA文 庫；
[0022] 其中，步驟（3)所述試劑1的pH值為7. 5,成分為去離子水、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、IOmM 二硫蘇糖醇、ImMγ_32ρ_ΑΤΡ、IOmM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶；
[0023] 步驟（4)所述試劑2的pH值為L 6,成分為去離子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA 連接酶、IOmM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs ;
[0024] 步驟（5)所述試劑3的pH值為L 6,成分為去離子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、 250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA 聚合酶和 12.5mM 引物混合液。
[0025] 步驟（1)所述樣品為孕12-24周的孕婦外周血的血漿。
[0026] 步驟（1)采用試劑盒提取DNA，所述試劑盒為金麥格血清游離DNA提取試劑盒。
[0027] 步驟⑵和步驟（6)所述磁珠為AMPure XP磁珠，篩選的DNA片段大小范圍是 250_350bp。
[0028] 步驟（4)所述DNA Adapter為正反兩個序列組成Y字的接頭，接頭的序列分別為：
[0029] 5 ' -AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3 '
[0030] 5 ' -GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCACXXXXXXATCTCGTATGCCGTCTTCTGCTTG-3'
[0031] 其中XXXXXX表示標簽接頭序列，選自SEQ ID N0:2-49,如下表所示：
[0032]
[0033] 步驟（5)中PCR擴增所使用的引物序列為：Primer 1如SEQ ID NO: 50所示：5'AA TGATACGGCGACCACCGAGATATACAC3'，Primer 2 如 SEQ ID N0:51**:5'CAAGCAGAACACGGCAT ACGAGAT3'。
[0034] 本發明第二方面提供了一種小片段DNA文庫，其由上述任一方法構建。
[0035] 本發明第三方面提供了一種用于構建基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小 片段DNA文庫的末端修復反應試劑，其pH值為7. 5,成分為去離子水、50mM Tris-Hcl、IOmM MgCl2、10mM 二硫蘇糖醇、lmMy-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ul T4多聚核苷酸激酶。
[0036] 本發明第四方面提供了一種用于構建基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小片 段0嫩文庫的接頭反應試劑，其？!1值為7.6，成分為去離子水、251^0嫩4(1?丨從、20(^/111 T4DNA 連接酶、IOmM MgCl2、50mM Tris-HCl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs。
[0037] 本發明第五方面提供了一種用于構建基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小 片段DNA文庫的PCR擴增反應試劑，其pH值為7. 6,成分為去離子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、10U/ul Taq DNA 聚合酶和 12.5mM 引物混合液。
[0038] 本發明的有益效果：
[0039] 與以往基于測序平臺的建庫流程相比，本發明建庫方法簡化了實驗流程，縮短建 庫時間，優化了反應體系，大幅度的減少試劑用量，降低建庫成本，并降低了文庫的損失，適 用于人為片段化的小DNA文庫的構建。
【附圖說明】
[0040] 圖1 :本發明小片段DNA文庫的構建流程圖。
[0041] 圖2 :采用Agilent Bioanalyzer 2100對本發明文庫的檢測結果圖。
[0042] 圖3 :文庫測序數據質檢結果圖。
【具體實施方式】
[0043] 下面通過實施例對本發明作進一步的詳細說明，旨在用于說明本發明而非限定本 發明。應當指出，對于本領域技術人員而言，在不脫離本發明原理的前提下，還可以對本發 明進行若干改進和修飾，這些改進和修飾，也同樣落入本發明的保護范圍之內。
[0044] 實施例1 :基于Illumina Hiseq 2500測序平臺的小片段DNA文庫的構建。
[0045] 1、試劑
[0046] 試劑1其pH值為7. 5,成分為去離子水、50mM Tris-HClUOmM MgCl2、10mM二硫蘇糖 醇（DTT)、lmMy-32p-ATP、10mM dNTPs、10U/ul T4DNA Polymerase/Klenow Fragment、10U/ ul T4多聚核苷酸激酶。
[0047] 試劑2其pH值為L 6,成分為去離子水、25uM DNA Adpter、200U/ul T4DNA連接酶、 IOmM MgCl2、50mM Tris-Hcl、50wt%甘油、ImM ATP、5mM dNTPs。
[0048] 試劑3其pH值為7· 6,成分為去離子水、IOOmM Tris-HCl、5mM MgCl2、250uM dNTPs、 10U/ul Tap DNA聚合酶和12. 5mM引物混合液。
[0049] 2、實驗步驟
[0050] (1)采集母體外周血，制備血漿
[0051] 在本實施例中，總共抽取48名孕婦外周血，編號為：ST01、ST02、ST03、ST04、ST05、 ST06、ST07、ST08、ST09、ST10、ST11、ST12、ST13、ST14、ST15、ST16、ST17、ST1