包含cd40l的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種疫苗，具體涉及一種包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法 與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 腎綜合征出血熱（Hemorrhagic fever with renal syndrome，HFRS)是由漢坦病毒 引起的急性病毒性傳染病，該病危害嚴重，病死率高，中國是世界上腎綜合征出血熱疫情最 嚴重的國家，目前，對于該病尚無特異有效的治療藥物，主要靠疫苗進行預(yù)防。國內(nèi)雖已研 制出腎綜合征出血熱滅活病毒疫苗，但是該類疫苗刺激機體產(chǎn)生中和抗體滴度較低，不能 有效刺激機體產(chǎn)生細胞免疫應(yīng)答，此外，原代細胞和腦組織滅活疫苗的材料多來源于動物， 而動物飼養(yǎng)的質(zhì)量控制問題，尤其是潛在的動物病毒對人體的可能危害是需要解決的關(guān)鍵 問題。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)已涌現(xiàn)出有多種疫苗研制的方法。
[0003] 病毒樣顆粒（Virus-like particle, VLP)是病毒復(fù)制過程中自然產(chǎn)生或通過基 因工程表達病毒結(jié)構(gòu)蛋白并自行組裝出的不含病毒核酸的顆粒樣物質(zhì)，除核酸外其結(jié)構(gòu)與 來源病毒基本一致，并具有與病毒最接近的抗原結(jié)構(gòu)和免疫學(xué)特性。VLP的這種特點使其在 疫苗的研宄中倍受青睞?，F(xiàn)在常用昆蟲細胞表達系統(tǒng)制備VLP，但是對于多個蛋白組成的 VLP，需要制備表達各個蛋白的桿狀病毒，再將這些桿狀病毒以不同的比例共同感染昆蟲細 胞，包裝出所需要的VLP，由于重組桿狀病毒在表達中必不可少，產(chǎn)品中混合的桿狀病毒為 后期純化帶來一定的困難。另外，昆蟲細胞表達系統(tǒng)糖基化與哺乳動物細胞仍有差別，這可 能會影響后期的免疫效果。而哺乳動物細胞表達系統(tǒng)由于翻譯后修飾、蛋白折疊等過程的 高保真性，成為最廣泛應(yīng)用于VLP研宄和工業(yè)生產(chǎn)的表達系統(tǒng)。哺乳動物細胞適用于各類 復(fù)雜的包膜VLP的表達，并且其表面的蛋白組成與原病毒最為接近。此外，哺乳動物細胞可 通過篩選構(gòu)建穩(wěn)定表達VLP的細胞系，有利于疫苗的研宄和工業(yè)化生產(chǎn)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒及其制備方法與應(yīng)用，作 為腎綜合征出血熱的預(yù)防疫苗。
[0005] 本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是： 包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，其特征在于： 基于哺乳動物細胞表達系統(tǒng)能夠正確折疊、組裝和翻譯后修飾蛋白的特點，通過構(gòu)建 真核表達載體，共轉(zhuǎn)染dhff CHO細胞，組裝含有⑶40L的漢坦病毒樣顆粒。
[0006] 所述制備方法由以下步驟實現(xiàn)： 步驟一：載體構(gòu)建： 將漢坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，構(gòu)建S基因表 達載體； 將漢坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，⑶40L基因克 隆入SV40啟動子下，構(gòu)建M基因和⑶40L基因的共表達載體； 步驟二：包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒的制備： 將步驟一得到的兩種載體各10 μ g共轉(zhuǎn)染dhfr_ CHO細胞，于培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去 培養(yǎng)基，PBS洗滌三次后加入無血清篩選培養(yǎng)基，48 h后收集含有VLP的培養(yǎng)上清；離心去 除細胞碎片及大的蛋白聚集體后，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，低溫保存。
[0007] 步驟二中，培養(yǎng)基為含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黃嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的 IMDM培養(yǎng)基。
[0008] 步驟二中，無血清篩選培養(yǎng)基為含500 nM MTX、800 μg/ml G418的Hycell培養(yǎng)基。
[0009] 如所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法制得的病毒樣顆粒。
[0010] 如所述的包含CD40L的漢坦病毒樣顆粒在制備腎綜合征出血熱預(yù)防疫苗方面的 應(yīng)用。
[0011] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點： 1、通過構(gòu)建真核表達載體，使嵌合VLP的各個組分均能表達，在細胞內(nèi)能組裝出結(jié)構(gòu) 正確的含有CD40L的漢坦病毒樣顆粒并釋放至培養(yǎng)上清中，CD40L分子錨定在病毒樣顆粒 的包膜上，從而可以有效的發(fā)揮免疫增強作用。
[0012] 2、構(gòu)建的真核表達載體上含有多個篩選標記，通過篩選可以建立穩(wěn)定表達嵌合病 毒樣顆粒的細胞株，便于大規(guī)模生產(chǎn)和制備。
[0013] 3、本發(fā)明制備的含有⑶40L的漢坦病毒樣顆粒，免疫小鼠后可以有效刺激產(chǎn)生體 液免疫和細胞免疫應(yīng)答，并且對病毒感染的小鼠有保護作用，可用于漢坦病毒感染的預(yù)防。
【附圖說明】
[0014] 圖1為漢坦病毒嵌合VLP載體構(gòu)建示意圖。
[0015] 圖2為間接免疫熒光檢測糖蛋白GP和⑶40L的表達。
[0016] 圖3為⑶40L-VLP透射電鏡檢查結(jié)果（A.轉(zhuǎn)染細胞樣品；B.細胞培養(yǎng)上清，VLP直 徑為 86. 13nm)。
[0017] 圖 4 為 CD40L-VLP Western-blot 檢測結(jié)果。
[0018] 圖5為⑶40L-VLP免疫后小鼠血清中特異性抗體的檢測。
[0019] 圖6為⑶40L-VLP免疫后小鼠血清中中和抗體的檢測。
[0020] 圖7為⑶40L-VLP免疫后小鼠脾細胞細胞因子分泌水平檢測。
[0021] 圖8為⑶40L-VLP免疫后小鼠脾細胞CTL殺傷活性檢測。
[0022] 圖9為CD40L-VLP免疫小鼠經(jīng)HTNV攻擊后臟器組織中病毒抗原的ELISA檢測結(jié) 果。
[0023] 圖10為CD40L-VLP免疫小鼠經(jīng)HTNV攻擊后臟器組織中HTNV核酸的qRT-PCR檢 測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0024] 下面結(jié)合【具體實施方式】對本發(fā)明進行詳細的說明。
[0025] 漢坦病毒是單負鏈RNA病毒，其基因組包括L、M、S三個片段，分別編碼病毒RNA依 賴的RNA聚合酶、包膜糖蛋白Gn和Gc以及核衣殼蛋白。包膜糖蛋白和核衣殼蛋白都是誘 導(dǎo)機體免疫應(yīng)答的主要結(jié)構(gòu)蛋白，糖蛋白可刺激機體產(chǎn)生中和抗體，在機體的保護性體液 免疫應(yīng)答中起主要作用，但其免疫原性弱，刺激機體細胞免疫應(yīng)答的能力較弱；核衣殼蛋白 的免疫原性較強，但不能有效刺激機體產(chǎn)生中和抗體。本發(fā)明中通過真核表達系統(tǒng)，在哺乳 動物細胞表達一種含有CD40L的漢坦病毒樣顆粒，其組成正確，在小鼠體內(nèi)能夠有效地刺 激產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，且對病毒感染的小鼠具有一定的保護作用。
[0026] 本發(fā)明涉及的包含⑶40L的漢坦病毒樣顆粒的制備方法，基于哺乳動物細胞表 達系統(tǒng)能夠正確折疊、組裝和翻譯后修飾蛋白的特點，通過構(gòu)建真核表達載體，組裝含有 CD40L的漢坦病毒樣顆粒，具體由以下步驟實現(xiàn)： 步驟一：載體構(gòu)建： 將漢坦病毒76-118株核蛋白S基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，構(gòu)建S基因表 達載體（圖1中A載體）； 將漢坦病毒76-118株糖蛋白M基因克隆入pCI-neo載體CMV啟動子下，⑶40L基因克 隆入SV40啟動子下，構(gòu)建M基因和⑶40L基因的共表達載體（圖1中B載體）； 上述兩個載體具有如下特征： 1、在啟動子區(qū)使用了增強轉(zhuǎn)錄的調(diào)控序列EASE2. 1，該序列可使轉(zhuǎn)錄活性提高70%，從 而提尚目的蛋白的表達量。
[0027] 2、表達M基因的載體切除了 G418抗性篩選基因，將⑶40L基因構(gòu)建在該位置上， ⑶40L和糖蛋白M基因同時表達，使⑶40L錨定在包裝出的VLP包膜上，有利于⑶40L發(fā)揮 免疫佐劑的作用，增強VLP所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答；表達S基因的載體對G418抗性基因進行了 E182D突變，以利于篩選高表達細胞株。
[0028] 3、在載體中使用了內(nèi)核糖體進入位點（IRES)，利用IRES分段表達二氫葉酸 還原酶（DHFR)。表達S基因的載體只表達DHFR1-105氨基酸，表達M基因的載體只表達 DHFR105-187氨基酸，這樣可高效迅速地篩選穩(wěn)定表達漢坦病毒嵌合VLP的細胞株，而且在 MTX加壓擴增過程中，有利于目的基因以等摩爾比例擴增，有利于進一步提高表達量，組裝 出結(jié)構(gòu)完整的VLP。
[0029] 4、針對DHFR進行了 L22R的突變，和野生型DHFR相比，降低了與MTX的親和力也 降低了活性，在達到篩選高效表達目的蛋白細胞株的同時使該表達系統(tǒng)可以在含有野生型 DHFR的細胞中進行MTX篩選，適用于更多的細胞類型。
[0030] 步驟二：漢坦病毒樣顆粒的制備： 將步驟一得到的兩種載體各10 μ g共轉(zhuǎn)染dhfr_ CHO細胞，于培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后棄去 培養(yǎng)基，PBS洗滌三次后加入無血清篩選培養(yǎng)基，48 h后收集含有VLP的培養(yǎng)上清；離心去 除細胞碎片及大的蛋白聚集體后，經(jīng)蔗糖密度梯度離心純化后，低溫保存。
[0031] 上述培養(yǎng)基為含10%FBS、100nM MTX、0.1 mM次黃嘌呤、0. 016mM胸腺嘧啶的頂DM培 養(yǎng)基。
[0032] 上述無血清篩選培養(yǎng)基為含500 ηΜ ΜΤΧ、800 μ g/ml G418的Hycell培養(yǎng)基。
[0033] 所制得的病毒樣顆粒可應(yīng)用于制備腎綜合征出血熱的預(yù)防疫苗。
[0034] 1、電鏡觀察VLP: 細胞轉(zhuǎn)染后48 h將細胞用胰蛋白酶消化后，裝入1.5 ml離心管，1000 rpm離心5 min， 棄上清，在細胞沉淀中加入戊二醛固定液。70%、80%、90%丙酮及純丙酮梯度脫水處理，并制 成包埋樣品，超薄切片后苯胺黑染色。在電鏡下觀察細胞樣品中的VLP的大小及形態(tài)。另 取純化后的VLP分別滴一小滴于銅網(wǎng)上，室溫放置90s，再滴一小滴磷鎢酸染色液于VLP液 體中，小心吸去多余液體，室溫靜置待其固定后在進行電鏡下觀察，以觀察上清中的VLP。
[0035] 2、Western-blot 檢測： 在經(jīng)純化的VLP樣本中加入10XSDS-PAGE loading buffer和β-巰基乙醇，混勻 后沸水浴5 min處理樣品和預(yù)染蛋白marker。取處理過的樣品40 μL加入蛋白凝膠進行 SDS-PAGE分析，160 V電泳50 min。電泳結(jié)束后取與凝膠相應(yīng)大小的PVDF膜用電轉(zhuǎn)儀進行 轉(zhuǎn)膜，100 V電轉(zhuǎn)45 min。電轉(zhuǎn)完畢后將印跡有蛋白的PVDF膜放入含5% BSA的PBST封閉 液中，室溫封閉2 h。加入稀釋好的抗病毒包膜糖蛋白和核衣殼蛋白的抗體以及CD40L多抗 (Gn mAb 和 Ge mAb 分別檢測 Gn 和 Gc，1A8 mAb 檢測 NP，CD40L pAb 檢測 CD40L)。4。C 孵 育8h，用PBST洗滌3次后，加入紅外標記的羊抗兔IgG和羊抗小鼠 IgG，4 ° C孵育4 h，用