菌液atp含量和od比值在發酵和發酵劑制備中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及菌株發酵培養領域，具體地，涉及一種在培養過程中通過測定菌液ATP 含量和OD值的比值以判斷發酵終點的方法，以及該方法在菌株保存，特別是在制備乳酸菌 發酵劑中的應用，本發明還涉及一種發酵劑的制備方法，以及由該方法制備的發酵劑。
【背景技術】
[0002] 在乳酸菌飲料或是干酪或是其他發酵制品生產的過程中，高品質的直投式發酵劑 是保證產品質量的前提。直投式發酵劑制備的過程主要包括了菌體的高密度發酵及發酵劑 的冷凍制備兩個部分。而這個過程中的諸多因素都會對終產品發酵劑的性能造成影響，比 如，發酵的條件、發酵收獲時間，冷凍操作過程等。
[0003] 發酵劑對于菌體的要求首先是具有高活性。其次是要有較高的耐受性，而并不僅 僅局限于對菌數的要求。在現有的發酵劑的生產過程中一般都是通過監控發酵過程中的pH 值，0D600值等數據指標，以判斷最適宜的菌種收獲時間。但通過常規的判斷方法所制備的 發酵劑不能夠得到菌體最理想的狀態，并且發酵劑的制備時間較長。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是為了克服以上缺陷，一方面，提供了一種菌株的發酵培養方法，該 方法包括：將菌株接種到培養液中進行發酵培養，其中，在發酵培養的過程中，測定菌液的 ATP含量和OD值的比值，并使其達到頂點，以結束發酵培養。
[0005] 第二方面，本發明還提供了如上所述的方法在菌株保存中的應用。
[0006] 第三方面，本發明還提供了一種發酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照如上 所述的方法對用于制備發酵劑的菌株進行培養，得到培養液。
[0007] 第四方面，本發明還提供了由以上方法制備的發酵劑。
[0008] 通過上述技術方案，在發酵培養的過程，測定菌液的ATP含量和OD值的比值，以該 比值達到頂點時作為發酵培養的終點以結束發酵過程。采用該方法培養得到的菌體具有較 高的活性和耐受性，且該時間點要早于通過單純測定0D600值或是監測活菌數判斷得到的 收獲時間點，因此，具有更短的發酵時間，并且，將這樣的菌體保存后再次用于發酵時能夠 表現出優越的發酵性能。
[0009] 本發明的其它特征和優點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0010] 附圖是用來提供對本發明的進一步理解，并且構成說明書的一部分，與下面的具 體實施方式一起用于解釋本發明，但并不構成對本發明的限制。在附圖中：
[0011] 圖1是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發酵培養過程中菌液ATP含量 隨發酵時間的變化曲線。
[0012] 圖2是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發酵培養過程中菌液pH值和 OD值隨發酵時間的變化曲線。
[0013] 圖3是保藏號為CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌在發酵培養過程中的菌液ATP/0D 值隨發酵時間的變化曲線。
【具體實施方式】
[0014] 以下對本發明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體 實施方式僅用于說明和解釋本發明，并不用于限制本發明。
[0015] 本發明的發明人在研宄的過程中發現，ATP普遍存在于所有活的生物體中，被用來 貯存和傳遞化學能，在微生物菌體中也不例外，微生物死亡后，在細胞內酶的作用下，其體 內的ATP會被很快的降解掉；而對于一定生理時期內的活體微生物，其體內的ATP會保持在 一個較為恒定的水平。而ATP作為一種能量的載體，同時也反應了菌體內能量代謝水平的 情況，菌體內含有的ATP含量越高，代表了菌體處于一個更活躍的能量代謝狀態。而對于乳 酸菌來說，其產生ATP的途徑主要是通過葡萄糖或乳糖向乳酸轉化的過程實現的，ATP含量 越高，代表了葡萄糖向乳酸轉化效率越高，表征了此時菌體具有更高的發酵活性。
[0016] 基于以上發現，本發明的發明人試圖通過在菌體培養的過程中，通過測定菌體體 內ATP的含量，當其達到最高點時，結束發酵以進行乳酸菌發酵劑的制備，而不是通過常規 的通過測定OD值或是pH的方法，當培養進行對數末期時結束發酵，以進行乳酸菌發酵劑的 制備。但通過這樣的方法制備得到的發酵劑性能的改善程度并沒有達到預期的效果，并且 制備時間較長。
[0017] 本發明的發明人又發現，通過在發酵過程中，分別測定菌體體內ATP的含量以及 OD值，并計算兩者的比值，也即，得到單位菌體密度的ATP含量，通過以該比值達到頂點為 基準，來判斷發酵終點。這樣基本上保證了每個菌體細胞內的ATP含量均處于一個最佳的 水平。以該方法制備得到的發酵劑的性能能夠得到提高。例如，通過如上方法判斷發酵培 養的終點，能夠使菌體達到最大的活性，并且得到的菌體對環境也具有較高的耐受性，將這 樣的菌體保存后再次用于發酵時能夠表現出優越的發酵性能。并且采用該方法能夠提早結 束發酵過程，使得發酵時間縮短，帶來了較高的社會效益。
[0018] 基于以上發現，一方面，本發明提供了一種菌株的發酵培養方法，該方法包括：將 菌株接種到培養液中進行發酵培養，其中，在發酵培養的過程中，測定菌液的ATP含量和OD 值的比值，并使其達到頂點，以結束發酵培養。
[0019] 根據本發明，術語"頂點"并非是嚴格意義上指代的一個特定的具體點值，其根據 培養菌株的不同，培養條件的不同以及對所述頂點要求程度的不同而會在一定的范圍內有 所差別。所述頂點即可以理解為菌液中ATP的含量和OD值的比值的頂點值，也可以理解為 當菌液中ATP的含量和OD值的比值達到頂點值時所對應的時間。
[0020] 根據本發明，確定菌液的ATP含量和OD值比值達到頂點的方法沒有特別的限制， 本領域技術人員可以采用常規的方法進行確定。例如，可以在發酵培養的過程中較粗略的 獲得該頂點：具體的，在菌體發酵培養的過程中，通過間隔取樣或是在線時時監控的方法， 測定培養液中ATP的含量以及OD值，計算得出培養液中ATP的含量和OD值的比值，待觀察 到的比值剛有所下降時立即結束發酵培養，該時間點便為所述頂點。其中，當通過間隔取樣 的方法確定所述頂點時，當所述比值在上升緩慢階段時，可以適當的縮短取樣的間隔。還 例如，可以通過提前繪制曲線的方法精確獲得所述頂點，具體的，將同一菌株進行預發酵培 養，培養基的組成以及培養條件與正常培養時完全相同，在培養的過程中通過間隔取樣或 是在線時時監控的方法，測定培養液中ATP的含量以及OD值，計算得出培養液中ATP的含 量和OD值的比值，然后以培養時間為橫坐標，ATP的含量和OD值的比值為縱坐標繪制發酵 曲線，從而得到所述頂點。
[0021] 其中，所述ATP的含量和OD值的測定方法可以為本領域常規的測定方法，例如，可 以使用微生物細胞活力分析儀（Microbial Cell Viability Assay)并按照其說明書進行 ATP含量的測定，可以通過常規的分光光度計或是酶標儀進行OD值的測定。
[0022] 其中，微生物細胞活力分析儀是通過如下的原理進行檢測的：
[0023] ATP生物發光法的原理就是在熒光素酶E和Mg2+的作用下，熒光素 LH與ATP發生 腺苷酰化被活化，活化后的熒光素與熒光素酶相結合，形成了熒光素一AMP復合體，并放出 焦磷酸。該復合體被分子氧所氧化，形成激發態復合物Ρ*-Ε · AMP，放出CO2，當該復合物從 激發態回到基態時發射光，從而被儀器檢測到。
[0024] 本發明對待培養的菌株沒有特別的限制，由于采用本發明的方法可以獲得活性和 耐受性較高的培養菌株，并且在后期使用時，所述獲得的培養菌株能夠較快的進入狀態并 積極發揮活性。因此，本發明的方法特別適用于需要進行保存的任何菌株的培養，待培養結 束后，可以進行常規的保存，例如，甘油管的保存，制備成凍干粉的保存等等。
[0025] 在本發明一種特別優選的實施方式中，所述菌株為乳酸菌菌株，優選的，所述乳酸 菌菌種包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根 據本發明一種具體的實施方式，所述乳酸菌為保藏號CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0026] 因此，第二方面，本發明提供了如上所述的方法在菌株保存中的應用。
[0027] 所述菌株可以為任何需要保存的菌株。在本發明一種特別優選的實施方式中，所 述菌株為乳酸菌菌株，優選的，所述乳酸菌菌株包括乳桿菌屬、鏈球菌屬、明串珠菌屬、雙歧 桿菌屬和乳球菌屬中的一種或多種。根據本發明一種具體的實施方式，所述乳酸菌為保藏 號CGMCC No. 9800的副干酪乳桿菌。
[0028] 另外，第三方面，本發明還提供了一種發酵劑的制備方法，其中，該方法包括：按照 如上所述的方法對用于制備發酵劑的菌株進行培養，得到培養液。
[0029] 根據