一種胰高血糖樣素肽-1的融合蛋白、其制備方法及其藥物組合物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及糖尿病相關的藥物領域，具體而言，本發明涉及具有延長胰高血糖素 樣肽類體內半衰期的重組蛋白，及其制備方法和藥物組合物，以及在制備糖尿病藥物方面 的應用。
【背景技術】
[0002] 本發明涉及的胰高血糖樣素肽-I (GLP-1, glucagon-likepeptide-1,以下簡 稱：GLP-1)主要是由小腸 L細胞分泌的一種37個氨基酸組成的多肽，其活性形式為 GLP-I (7-37)0H 和 GLP-I (7-36)NH2(Mojsov S，J Clin Invest. 1987Feb;79(2):616-9)。 GLP-I有明顯減低人用餐后的血糖，能刺激胰島素的產生，同時還能起到一定減肥效應，并 且不會引起低血糖癥（Drucker D J, Diabetes. 1998 Feb ;47(2) :159-69)。近期研究還表 明 GLP-I 對胰腺再生作用（Drucker D J, 2003Dec ; 144 (12) :5145-8)。然而，GLP-I (7-37) 的血清半衰期僅僅為3-5分鐘，涉及GLP-I肽的治療用途，來自蜥蜴唾液的人的GLP-I類似 物Exendin-4的合成物Exenatide, 2005年在美國作為降糖藥上市，血中的半衰期到2. 5小 時左右，每天需要在早飯及晚飯前注射給藥，每天多次注射給藥在臨床使用中非常不方便， 因此，延長GLP-I類似物的體內時間對于方便臨床應用具有重要的意義。
[0003] 目前已經有不少研究采用GLP-I類似物融合蛋白技術解決GLP-I類似物在體 內的存留時間[CN90101167. 3、CN200710018734. 2、CN200410054397. 9、CN01820232. 2、 CN200380110152. 7、CN200510039265. 3、CN200610127237. 1、CN200910009642. 7]，然而，現 有的技術與臨床理想的目標還有很大距離。本發明是針對現有技術的不足，采用融合蛋白 技術克服了 GLP-I半衰期短的問題。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是針對GLP-I是多肽分子，無法進行口服吸收的缺陷，通過與 疏水蛋白的融合表達形成一個具有穩定結構的、穩定的、可口服的治療2型糖尿病藥物。
[0005] 本發明的另一個目的是提供含有通式I結構的GLP-I融合蛋白作為有效成分以 及一種或多種藥學上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的藥用組合物，及其在制備糖尿病治 療藥物中的應用。
[0006] 現結合本發明的目的對本發明逐一加以描述。
[0007] 本發明胰高血糖樣素肽-1的融合蛋白如下述所示：具有通式I，
[0008] GLP-1- [SGTPTPTPTPTGEF]-融合蛋白
[0009] 通式 I [0010]其中，
[0011] 連接肽為 SGTPTPTPTPTGEF ;
[0012] GLP-I的氨基酸序列為：
[0013] 7-haegtftsdvssylegqaakefiawlvkgr-36
[0014] 融合蛋白為：疏水蛋白，其氨基酸序列為QQCTTGQLQCCESTSTANDPATSELLGLIGVVIS DVDALVGLTCSPISVIGVGSGSACTANPVCCDSSPIGGLVSIGCVPVNV。
[0015] 本發明的通式I的GLP-I融合蛋白是通過下述方法制備的：
[0016] 1.構建編碼本發明的融合蛋白的DNA
[0017] 本發明中的融合蛋白為疏水蛋白，本發明采用標準的PCR(聚合酶鏈式反應）方法 對相關的融合蛋白的mRNA進行擴增，并按照領域內眾所周知的方法進行DNA擴增，疏水蛋 白的DNA序列SEQ ID NO 1。
[0018] 2.構建本發明中GLP-I的DNA
[0019] 本發明參考專利CN1363654A中GLP-I中雙鏈DNA全長的合成方法，進行GLP-I雙 鏈DNA全長的合成，本發明中GLP-I經過標準的DNA測序進行序列驗證。
[0020] 3.構建本發明中GLP-I融合蛋白載體
[0021] 利用本領域常規的PCR突變技術制備連接有連接短肽的GLP-I用以與蛋白表達質 粒的連接；連接技術是本領域常規操作，本發明利用PCR將含有連接肽的GLP-I與蛋白表達 質粒通過T4連接酶（可以催化粘端或平端雙鏈DNA或RNA的5' -P末端和3' -OH末端之 間以磷酸二酯鍵結合，該催化反應需ATP作為輔助因子）進行連接，得到本發明中所有融合 蛋白的表達載體。一旦產生了編碼完整融合蛋白的表達載體，它可以用來傳染酵母菌株，生 產融合蛋白。重組DNA載體轉化或轉染細胞的技術是本領域的常規技術。
[0022] 4.用于重組表達本發明的融合蛋白的一般方法
[0023] 用本發明中的表達載體轉染或轉化宿主細胞，用于表達融合蛋白。參考本領域 常規的蛋白表達技術優化本發明中各種融合蛋白的表達，用于增加細胞培養物的原則、技 術（例如培養基、溫度、pH 等）可以參見 Mammalian Cell Biotechnology :A Practical Approach, M. Butler。本發明中的GLP-I融合蛋白的表達采用裝載pPIC9質粒的酵母菌株。
[0024] 5.本發明融合蛋白的純化：
[0025] -旦本發明的融合蛋白在適當的宿主細胞中表達，可以通過標準的蛋白分離和純 化技術對本發明中的融合蛋白進行純化。例如根據融合蛋白表達載體內的標簽進行融合蛋 白的粗提純。本發明中，純化后的融合蛋白可以通過超濾方法將其濃縮至藥用濃度，融合蛋 白經過紫外線的處理用以增加其藥用的安全性。
[0026] 本發明的融合蛋白的表征：
[0027] 本發明中，可以用許多方法表征本發明的融合蛋白。這些方法中的一些包括：與蛋 白染色偶聯的SDS-PAGE或免疫印跡技術。本發明中的融合蛋白通過免疫印跡的鑒定，例如 使用GLP-I的抗體。
[0028] 本發明的組合物：
[0029] 本發明所的GLP-I融合蛋白，可以與一種或多種藥學上可接受的輔料共同制成藥 物組合物，這些輔料包括：水溶性填充劑輔料、PH調節劑、穩定劑、注射用水、滲透壓調節劑 等等。該藥物組合物可以通過肌肉、靜脈內、皮下注射途經進行給藥，優選的劑型為凍干或 溶液注射劑。
[0030] 本發明所述的水溶性填充劑輔料包括：甘露醇、低分子右旋糖苷、山梨醇、聚乙二 醇、葡萄糖、乳糖、半乳糖等一種或幾種的組合。PH調節劑是枸櫞酸、磷酸、鹽酸等非揮發性 的酸以及氫氧化鉀、氫氧化鈉、或鉀或銨、碳酸鈉或鉀或銨鹽、碳酸氫鈉或鉀或銨鹽等生理 可接受的有機或無機酸和堿及鹽；
[0031] 穩定劑是EDTA-2Na(乙二胺四乙酸二鈉）、硫代硫酸鈉、焦亞硫酸鈉、亞硫酸鈉、磷 酸氫二鉀、碳酸氫鈉、碳酸鈉、精氨酸、谷氨酸、聚乙二醇6000、聚乙二醇4000、十二烷基硫 酸鈉或三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。優選焦亞硫酸鈉、磷酸氫二鉀、精氨酸、聚 乙二醇6000、三羥甲基氨基甲烷的一種或幾種的組合。
[0032] 滲透壓調節劑，是氯化鈉、氯化鉀的一種或兩種的組合。
[0033] 所述注射制劑的制備方法包括以下步驟：
[0034] (1)凍干劑
[0035] 取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓劑等，加入注射用水適量，調 節PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5 %活性炭，在10-25°C下攪拌10-20分 鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，采用冷凍干燥法，制得白色疏松塊狀物， 封口即得。
[0036] (2)溶液注射液
[0037] 取GLP-I融合蛋白和水溶性填充劑、穩定劑、滲透壓劑等，加入注射用水適量，調 節PH值至5-8. 5使其溶解，加水至刻度，加入0. 1-0. 5%活性炭，在10-25°C下攪拌10-20 分鐘，脫碳，采用微孔濾膜過濾除菌，濾液進行分裝，封口即得。
[0038] ⑶口服制劑
[0039] 本發明提供的GLP-I融合蛋白也可直接作為口服藥物用于治療2型糖尿病。
[0040] 本發明所的GLP-I融合蛋白具有更長的體內存留時間，可作為有效成分制備糖尿 病治療藥物。相當寬的劑量范圍內是有效的，劑量可由醫生根據有關的情況來決定，這些情 況包括：被治療者的身體狀態、給藥途徑、年齡、體重、對藥物的個體反應，癥狀的嚴重程度 等。一般來說，本發明活性成分的有效量lX10_ 7-20mg/kg/天，可以單劑量給藥或成分劑量 給藥。
【附圖說明】
[0041] 圖1是GLP-I融合蛋白的免疫印跡結果；
[0042] 圖2是GLP-I與GLP-I融合蛋白對小鼠耐糖能力的曲線圖；
[0043] 圖3是GLP-I與GLP-I融合蛋白對小鼠降血糖功能的對比圖。
【具體實施方式】
[0044] 下列實施利用以幫助描述如何實施本發明的各種實施方案。這些實施例是為了舉 例說明，而不是以任何方式限定本發明的范圍。
[0045] 實施例1 :疏水蛋白編碼DNA的構建
[0046] 本發明中將根據疏水蛋白的公開序列設計PCR引物，從灰樹花中釣取疏水蛋白的 mRNA。通過標準的mRNA逆轉錄技術，將融合的mRNA逆轉錄為DNA(SEQ ID NO 1)。
[0047] 實施例2 :GLP-1融合蛋白DNA構建
[0048] 本專利采用全基因合成制備GLP-I及連接肽的DNA，并通過T4連接酶方式與疏水 蛋白DNA進行連接，連接后DNA序列為（SEQ ID N02) SEQ ID NO 2:
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