多肽、包含該多肽的檢測器件和包含該器件的檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物檢測領域，特別是可用于腸道病毒71型的臨床輔助診斷的多肽、 包含該多肽的檢測器件的檢測試劑盒。
【背景技術】
[0002] 腸道病毒71型（Human enterovirus 71)，簡稱EV71，是引起嬰幼兒手足口病 (hand-foot and mouth disease ;HFMD)主要病原體之一。人類腸病毒71型于1969年首 次從加利福尼亞患有中樞神經系統疾病的嬰兒糞便標本中分離出來的。
[0003] EV71主要引起手足口病，還可引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質炎樣的麻 痹等多種神經系統疾病。手足口病和中樞神經系統感染是EV71感染而引起的兩大常見臨 床癥狀。病毒從咽部或腸道侵入，在局部黏膜或淋巴組織中繁殖，并由局部排出，此時可引 起局部癥狀。繼而病毒又侵入局部淋巴結，并由此進入血液循環導致第一次病毒血癥。病毒 經血循環侵入網狀內皮組織、深層淋巴結、肝、脾、骨髓等處大量繁殖并由此進入血液循環， 引起第二次病毒血癥。病毒可隨血流進入全身各器官，如中樞神經系統、皮膚黏膜、心臟等 處，進一步繁殖并引起病變。易感者感染EV71后，出現血管變態反應和組織炎癥病變。當 病毒累及中樞神經系統時，組織炎癥較神經毒性作用更加強烈，中樞神經系統小血管內皮 最易受到損害。細胞融合、血管炎性變、血栓形成可導致缺血和梗死。在脊髓索、腦干、間 腦、大腦和小腦的局部組織中，除嗜神經性作用外，還存在廣泛的血管周圍和實質細胞炎癥 道病毒71型危害極大，目前急需簡便快捷準確的儀器是實現對其的快速檢測。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的在于提供一種多肽、包含該多肽的檢測器件、以及包含該檢測器件 的檢測試劑盒，它們對腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診 斷是有用的。本發明目的在于提供該多肽在制備可用于腸道病毒71型診斷的檢測試劑盒 中的用途。
[0005] 即，本發明包含下述技術方案：
[0006] 1. -種多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO :1所示，即：⑶SVSRALTCALPAPTGQNT。
[0007] 2. -種檢測器件，其包括：
[0008] 固體載體，以及
[0009] 連接于該固體載體上的權利要求1所述的多肽。
[0010] 3.根據權利要求2所述的檢測器件，其中，所述固體載體是SJ改性硅膠。
[0011] 4.根據權利要求2所述的檢測器件，其用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒 71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0012] 5. -種檢測試劑盒，其包括權利要求2~4中任一項所述的檢測器件。
[0013] 6.根據權利要求5所述的檢測試劑盒，其用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病 毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0014] 7.權利要求1所述的多肽在制備檢測試劑盒中的用途。
[0015] 8.根據權利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒用于腸道病毒71型抗體 IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷。
[0016] 9.根據權利要求7所述的用途，其中，所述檢測試劑盒包括權利要求2~4中任一 項所述的檢測器件。
[0017] 將本發明應用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助 診斷，能夠取得令人滿意的效果。
【附圖說明】
[0018] 圖1對SJ改性硅膠（iPDMS薄膜）的制作過程進行說明的示意圖。
[0019] 圖2說明腸道病毒EV71型IgM多肽微陣列的點樣模式的示意圖。
[0020] 圖3說明腸道病毒EV71型IgM多肽微陣列的點樣模式的示意圖。
[0021] 圖4顯示對健康正常人或非腸道病毒71型感染病人血清進行檢測的結果的照片。
[0022] 圖5顯示對腸道病毒71型感染病人血清中的抗體IgM進行檢測的結果的照片。
[0023] 圖6顯示對腸道病毒71型感染病人血清中的抗體IgG進行檢測的結果的照片。
[0024] 發明的【具體實施方式】
[0025] 本發明的多肽
[0026] 在另一個方面中，本發明提供對對腸道病毒71型的早期篩查和臨床輔助診斷有 用的多肽，由SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列構成，即：⑶SVSRALTCALPAPTGQNT。如實施例 所示，本發明的多肽對腸道病毒71型感染病人的血清呈陽性反應，而對健康正常人或非腸 道病毒71型感染病人血清呈陰性反應。因此，本發明的多肽作為腸道病毒71型抗體IgM 或者腸道病毒71型抗體IgG的臨床輔助診斷工具是有用的。本發明的多肽可以用于制造 可用于腸道病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG臨床輔助診斷的檢測器件（例 如下述的本發明的檢測器件）或檢測試劑盒（例如下述的本發明的檢測試劑盒）。
[0027] 本發明的多肽可以適宜采用（1)化學合成方法、或（2)酶反應合成方法等公知方 法來獲得，但不限于此，其中化學合成更為簡便。在化學合成本發明的多肽情況下，通過使 用肽合成儀合成或者半合成該多肽來進行。作為化學合成方法，可以列舉出例如肽固相合 成法等。這樣合成的肽可以采用常規手段例如離子交換色譜、反相高效液體色譜、親和色譜 等進行純化。這樣的肽固相合成方法以及其后的肽純化都是本技術領域公知的。
[0028] 此外，在通過酶反應生產本發明的多肽的情況下，可以采用例如國際公開小冊子 W02004/011653號所述的方法。即，可以這樣來生產：將一方的氨基酸或二肽的羧基末端被 酯化或酰胺化而得到的氨基酸或二肽、與氨基酸處于游離狀態的氨基酸（例如羧基保護的 氨基酸）在肽合成酶的存在下進行反應，生成的二肽或三肽。作為肽合成酶，可以列舉出： 具有生成肽的能力的微生物的培養物、由該培養物分離的微生物菌體、或該微生物的菌體 處理物、或該微生物來源的肽合成酶。
[0029] 而且，除了上述的酶方法、化學合成方法以外，還可以采用例如基因工程方法來生 產本發明的多肽。
[0030] 本發明的多肽的氨基酸序列可以采用常規的方法進行分析和確認，例如可以利用 質譜、色譜等方法來進行分析和確認。
[0031] 本發明的檢測器件
[0032] 在另一方面中，本發明還提供一種檢測器件（本發明的檢測器件），其包括固體載 體、以及連接于該固體載體上的本發明的蛋白質或本發明的多肽。所述檢測器件對于腸道 病毒71型抗體IgM或者腸道病毒71型抗體IgG臨床輔助診斷是有用的。
[0033] 在本發明中，對固體載體沒有特殊限制，只要是作為固體或不溶性材料（例如是 可以通過過濾、沉淀、磁性分離等從反應混合物中分離的材料）的載體即可。
[0034] 構成固體載體的材料包括但不限于：硅膠（聚二甲基硅氧烷，PDMS)、纖維素、特 氟隆TM、硝基纖維素、瓊脂糖、葡聚糖、殼聚糖、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚 酰胺、聚丙烯、尼龍、聚偏二氟乙烯、膠乳、二氧化硅、玻璃、玻璃纖維、金、鉑、銀、銅、鐵、不銹 鋼、鐵氧體、硅晶片、聚乙烯、聚乙烯亞胺、聚乳酸、樹脂、多糖類、蛋白（白蛋白等）、碳或它 們的組合等。
[0035] 固體載體的形狀包括但不要限于：珠子、磁珠、薄膜、微細管、濾膜、板、微量板、碳 納米管、傳感器芯片等。正如本技術領域公知的那樣，薄膜或板等平坦的固體載體上可以設 置凹坑、溝槽、濾膜底部等。
[0036] 在本發明中，磁珠可以具有約25nm~約Imm范圍的球體直徑。在優選的實施方式 中，磁珠具有約50nm~約10 μ m范圍的直徑。磁珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0037] 在本發明中，由Sepharose等高交聯球形瓊脂糖制成的珠子具有約24 μm~約 165 μ m范圍的直徑。優選地，高交聯球形瓊脂糖珠具有約24 μ m~約44 μ m范圍的直徑。 高交聯球形瓊脂糖珠的尺寸可以根據特定的用途來進行選擇。
[0038] 具有疏水性表面的固體載體的例子包括可從Polysciences，Warrington，PA或 Spherotech，Liberville，IL購買的制品等聚苯乙稀膠乳珠。
[0039] 二氧化硅（Si02)_處理或二氧化硅（Si02)基的固體載體的例子包括可從 Polysciences，Warrington，PA購買的超常磁性二氧化娃珠等，其可以用于捕捉核酸（例如 DNA)。或者，還可以使用可從Dynal Biotech購買的M-280等。
[0040] 具有親水性表面的磁珠可用于捕捉增殖期的細菌細胞、核酸以及其它成分。作為 該磁珠的例子，可以列舉出Polysciences，Warrington，PA銷售的珠子（名稱：Biomag (注 冊商標）羧基）、或者 Bangs Laboratory，Inc.，Fishers，IN 的名稱為 MC02N/2928 的珠子。 或者，可以使用Dynal Biotech銷售的M-270等。
[0041] 在本發明的一個優選實施方式中，所述固體載體是SJ改性硅膠，其是蘇州傯聚生 物材料有限公司開發的一種硅橡膠材質的微陣列固體支撐材料（iPDMS薄膜，參見中國專 利公開CN101265329A)。這種材料是以生物學研宄常用的PDMS為基礎，在其中加入特定的 引發劑成分（使該材料可通過表面引發聚合反應（SIP)實現表面功能化修飾），再經過聚乙 二醇甲基丙稀酸醋（p〇ly(〇lig〇(ethylene glycol)methacrylate)，pOEGMA)表面修飾獲得 的。SJ改性硅膠具有優秀的抗蛋白質非特異性吸