Aav變體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及編碼腺伴隨病毒（AAV)衣殼蛋白質變體的核酸、包含衣殼蛋白質變體 的AAV顆粒和通過使用所述顆粒生產基因轉導細胞的方法。
[0002] 領域背景 AAV是具有4. 7 kb的線性單鏈DNA基因組的病毒，其包括兩種基因 rep和cap的開 放讀碼框。rep基因編碼基因組復制所需的四種蛋白質（Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)。 cap基因表達裝配用于病毒衣殼形成的三種衣殼蛋白質（VP1、VP2、VP3)和裝配激活蛋白質 (assembly-activating protein) (AAP)。AAV的復制實質上依賴于輔助病毒，諸如腺病毒 或皰瘆病毒的存在。在不存在輔助病毒的情況下，AAV的基因組維持在附加體狀態或整合 至宿主的染色體中，所以AAV是以潛伏狀態存在。目前鑒定了 AAV的超過100種血清型和 分化體（clade)(非專利文獻1)。特別地，基于AAV2的用于基因遞送的載體的發展是先進 的。
[0003] 在1989年，首次開發了基于AAV2的基因遞送載體系統。已經發現基于AAV的載 體具有很多優點。因為野生型AAV是非致病的，并且不具有與任何已知疾病的病原關系，相 信基于AAV的載體是極其安全的。此外，AAV具有高基因轉導效率。
[0004] AAV顆粒的施用能夠長期并且穩定的將基因轉導至多種靶器官和靶細胞中。到目 前為止，已經報道了對骨骼肌、肝臟(肝細胞)、心臟(心肌細胞)、神經細胞、胰腺細胞和胰島 細胞的高效率基因轉導。此外，AAV已經被用于人臨床試驗。在另一方面，已經進行了通過 改造 AAV衣殼蛋白質以改變AAV細胞嗜性（cell tropism)的嘗試和通過中和抗體避免AAV 顆粒移除的嘗試。例如，已經建立了對特定器官和細胞，諸如神經膠質細胞、呼吸道上皮細 胞、冠狀動脈血管內皮細胞（coronary artery vascular endothelial cell)和肺具有嗜 性的AAV衣殼，以及對腫瘤細胞，諸如成膠質細胞瘤細胞、黑素瘤細胞、肺癌細胞和乳腺癌 細胞具有嗜性的AAV衣殼(非專利文獻2)。
[0005] 引用列表 非專利文獻 非專利文獻 l:Gao 等人，J. Virology, Vol. 78，PP. 6381-6388,2004 非專利文獻 2: Adachi Κ·等人，Gene Ther. Regul. Vol. 5, ρρ· 31-55，2010。
[0006] 發明概述 通過本發明解決的問題 本發明的目的包括提供對心臟和免疫器官，特別地，對淋巴結具有嗜性的AAV衣殼蛋 白質，并且提供將基因高效率地導入淋巴結的方法。
[0007] 對問題的解決 本發明為解決上文描述的問題進行了集中地努力，并且結果建立了包括具有選自序列 表 SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO :24 和 SEQ ID NO :30 的氨基酸序列的 AAV 衣 殼蛋白質。因此完成本發明。
[0008] 本發明一般性涉及：
[1] 編碼腺伴隨病毒（AAV)衣殼蛋白質變體的核酸，所述變體包含具有選自序列表SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO :24 和 SEQ ID NO :30 的氨基酸序列的肽；
[2] 根據[1]的所述核酸，其中AAV衣殼蛋白質來源于AAV2 ;
[3] 根據[1]的所述核酸，其中所述肽位于AAV2的VPl中氨基酸編號588后接的位置 處；
[4] 包括根據[1]至[3]中任一項所述核酸的重組DNA ;
[5] 包括根據[1]至[3]中任一項所述核酸或根據[4]的所述重組DNA的細胞；
[6] 包括AAV衣殼蛋白質變體的AAV顆粒，所述變體包含具有選自序列表SEQ ID NO : 15、SEQ ID NO : 16、SEQ ID NO :24 和 SEQ ID NO :30 的氨基酸序列的肽；
[7] 根據[6]的所述AAV顆粒，其中AAV衣殼蛋白質來源于AAV2 ;
[8] 根據[6]的所述AAV顆粒，其中肽位于AAV2的VPl中氨基酸編號588后接的位置 處；
[9] 生產基因轉導細胞的方法，所述方法包括將包括AAV衣殼蛋白質變體的AAV顆粒與 細胞接觸的步驟，所述變體包含具有選自序列表SEQ ID N0:15、SEQ ID N0:16、SEQ ID NO: 24和SEQ ID NO :30的氨基酸序列的肽；
[10] 根據[9]的方法，其中AAV衣殼蛋白質來源于AAV2 ;并且
[11] 根據[9]的方法，其中所述肽位于AAV2的VPl中氨基酸編號588后接的位置處。
[0009] 本發明效果 根據本發明，提供了可用于轉導入心臟和免疫器官基因的基因轉導系統。本發明的AAV 顆粒對免疫器官，特別地，對淋巴結具有高細胞嗜性，并且通過AAV顆粒轉導的基因可以強 烈表達。
[0010] 附圖簡述 圖1顯示了生產能夠使衣殼蛋白質含有隨機肽的核酸構建體的方法。
[0011] 實施本發明的模式 如在本文中使用的，"腺伴隨病毒"指的是屬于依賴病毒屬（Dependovirus)的小病毒， 其屬于細小病毒科（Parvovirdiae)，并且能夠感染靈長類動物(包括人）和其它哺乳動物。 在下文中，將腺伴隨病毒縮寫為AAV。AAV具有正二十面體的無包膜外殼(衣殼)和在殼中的 線性單鏈DNA。如在本文中使用的，除非另有說明，AAV包括野生型病毒及其衍生物，并且包 括AAV的全部血清型和分化體。
[0012] 如在本文中使用的"載體"意指用于介導多核苷酸對細胞遞送的分子或締合分子 (associated molecule)，并且其包括多核苷酸或與多核苷酸締合。除非另有說明，載體的 實例包括載體DNA，諸如質粒載體和噬菌體載體，病毒載體顆粒、脂質體和其它用于基因遞 送的載體。
[0013] 如在本文中使用的"衣殼蛋白質"意指通過存在于AAV基因組中的cap基因編碼 并且構成AAV衣殼的蛋白質。野生型AAV基因組編碼三種衣殼蛋白質，并且它們是VPl、VP2 和VP3。如在本文中使用的，衣殼蛋白質包括VP1、VP2和VP3。
[0014] (1)編碼AAV衣殼蛋白質變體的核酸 本發明的核酸編碼AAV衣殼蛋白質的變體，所述變體包含具有選自序列表SEQ ID NO: 15、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :24 和 SEQ ID NO :30 的氨基酸序列的肽。
[0015] 通過本發明核酸編碼的AAV衣殼蛋白質變體可以通過將所述肽插入至任何AAV (諸如 AAV 類型 I (AAV1)、AAV 類型 2 (AAV2)、AAV 類型 3 (AAV3)、AAV 類型 4 (AAV4)AAV 類 型 5 (AAV5)、AAV 類型 6 (AAV6)、AAV 類型 7 (AAV7)、AAV 類型 8 (AAV8)、AAV 類型 9 (AAV9)、 AAV 類型 10 (AAV10)、AAV 類型 11 (AAV11)、禽 AAV、牛 AAV、犬 AAV、馬 AAV 或羊 AAV)的 AAV 衣殼蛋白質，或使用所述肽替換部分AAV衣殼蛋白質氨基酸序列（換而言之，通過產生包含 所述肽的AAV衣殼蛋白質）制備。在本發明中，優選地使用AAV2的衣殼蛋白質。
[0016] 對于本發明的核酸，使AAV衣殼蛋白質含有的肽具有選自序列表SEQ ID NO: 15、 SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :24和SEQ ID NO :30的氨基酸序列。此外，可以向肽的N端和 /或C端添加間隔序列（spacer sequence)。間隔序列優選地由1至5個氨基酸殘基組成。 組成間隔序列的氨基酸殘基是特別限制的。例如，間隔序列可以包括選自丙氨酸和絲氨酸 的氨基酸。
[0017] 對于被制成含有所述肽的AAV衣殼蛋白質，可以使用AAV VP1、VP2或VP3。可以 僅VP1、VP2和VP3中任意一種被制成含有所述肽，或可以VP1、VP2和VP3的全部被制成含 有所述肽。此外，兩種衣殼蛋白質，諸如VPl和VP2、VP2和VP3或VPl和VP3可以被制成 含有所述肽。通過AAV基因組中的cap基因區域編碼VPl至VP3。在本發明的一個實施方 案中，由VPl至VP3共享的區域被制成含有所述肽，因此可以將突變導入至全部VPl至VP3 中。在本發明的另一個實施方案中，編碼VPI、VP2或VP3的基因從AAV的cap基因分別制 備，并且將突變導入至所述基因。在該情況中，可以執行處理，所述處理抑制由其中已插入 突變的基因編碼的衣殼蛋白質對應的衣殼蛋白質從AAV cap區域的表達。
[0018] 在使用AAV2 VPl的情況下，通過本發明的核酸編碼的AAV衣殼蛋白質變體優選地 含有位于氨基酸編號第588號后的肽，也就是，位于氨基酸編號588后的位置。AAV2 VPl的 氨基酸編號588對應AAV2 VP2的氨基酸編號451和AAV2 VP3的氨基酸編號386。本領域 技術人員可以容易地鑒定AAV2之外的AAV血清型和分化體的衣殼蛋白質的氨基酸(其對應 于在AAV2 VPl氨基酸編號588的氨基酸)。例如，見在Gao等人Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 99，No. 18，pp. 11854-11859，2002中顯示的VPl的氨基酸序列對比。例如， AAV2 VPl的氨基酸編號588對應AAVl的氨基酸編號589、AAV7的氨基酸編號590和AAV8 的氨基酸編號591。
[0019] 通過