改善生產力和物理性質所制備的抗體可以優選為包括含有由SEQ ID N0.2的重鏈CDRl，由SEQ ID N0.16所代表的重鏈CDR2，和由SEQ ID N0.10所代表的重鏈⑶R3的重鏈可變區，以及含有由SEQ ID N0.17所代表的輕鏈⑶Rl，由SEQ IDN0.7所代表的輕鏈CDR2，和由SEQ ID N0.15所代表的輕鏈CDR3的輕鏈可變區的抗體，并且更優選為包括SEQ ID N0.18的重鏈可變區(H6)以及SEQ ID N0.19的輕鏈可變區(L2)的抗體。在本發明的一個實施方案中，所述包括SEQ ID N0.18的重鏈可變區以及SEQ IDN0.19的輕鏈可變區的抗體被命名為‘Ab417-H6L2’。
[0070]通過Ab417抗體的突變以改善生產力和物理性質所制備的抗體可以優選為包括含有由SEQ ID N0.2所代表的重鏈CDRl，由SEQ ID N0.16所代表的重鏈CDR2，和由SEQ IDN0.10所代表的重鏈⑶R3的重鏈可變區，以及含有由SEQ ID N0.6所代表的輕鏈⑶R1，由SEQ ID N0.7所代表的輕鏈⑶R2，和由SEQ ID N0.15所代表的輕鏈⑶R3的輕鏈可變區的抗體，并且更優選為包括SEQ ID N0.18的重鏈可變區(H6)以及SEQ ID N0.21的輕鏈可變區(LI)的抗體。該抗體被命名為‘Ab417-H6L1’。
[0071]通過Ab417抗體的突變以改善生產力和物理性質所制備的抗體可以優選為包括含有由SEQ ID N0.2所代表的重鏈CDRl，由SEQ ID N0.9所代表的重鏈CDR2，和由SEQ IDN0.10所代表的重鏈⑶R3的重鏈可變區，以及含有由SEQ ID N0.6所代表的輕鏈⑶R1，由SEQ ID N0.7所代表的輕鏈⑶R2，和由SEQ ID N0.15所代表的輕鏈⑶R3的輕鏈可變區的抗體，并且更優選為包括SEQ ID N0.20的重鏈可變區以及SEQ ID N0.21的輕鏈可變區的抗體。在本發明的一個實施方案中，所述包括SEQ ID N0.20的重鏈可變區(H5)以及SEQID N0.21的輕鏈可變區(LI)的抗體被命名為‘Ab417-H5L1’。
[0072]通過Ab417抗體的突變以改善生產力和物理性質所制備的抗體可以優選為包括含有由SEQ ID N0.2所代表的重鏈CDRl，由SEQ ID N0.9所代表的重鏈CDR2，和由SEQ IDN0.10所代表的重鏈⑶R3的重鏈可變區，以及含有由SEQ ID N0.17所代表的輕鏈⑶Rl，由SEQ ID N0.7所代表的輕鏈⑶R2，和由SEQ ID N0.15所代表的輕鏈⑶R3的輕鏈可變區的抗體，并且更優選為包括SEQ ID N0.20的重鏈可變區(H5)以及SEQ ID N0.19的輕鏈可變區(L2)的抗體。該抗體被命名為‘Ab417-H5L2’。
[0073]與現有抗體相比，本發明的各種結合LlCAM的抗體提供針對人和小鼠LlCAM的高親和力，從而以高親和力特異性結合L1CAM。因此，本發明的抗體可以被用于采用LlCAM抗原識別的任何應用。
[0074]在本發明的一個實施方案中，進行結合人和小鼠LlCAM的抗體Ab4的氨基酸的各種置換發現，根據Kabat進行編號的將作為重鏈可變區(SEQ ID N0.1)的位置97的一種氨基酸殘基(SEQ ID N0.1的位置101的一種氨基酸殘基)的組氨酸置換為丙氨酸(H97A)、作為重鏈可變區的位置50的一種氨基酸殘基的纈氨酸置換為苯丙氨酸(V50F)和作為輕鏈可變區(SEQ ID N0.5)的位置93的一種氨基酸殘基的天冬氨酸置換為丙氨酸(D93A)對于LlCAM親和力的改善是重要的(圖1)。特別地，由除了 H97A、V50F、D93A的置換之外的另外的作為輕鏈可變區的位置75的一種氨基酸殘基的纈氨酸置換為異亮氨酸和作為輕鏈可變區的位置84的一種氨基酸殘基的甘氨酸置換為丙氨酸所制備的Ab4M抗體被發現具有既針對人又針對小鼠LlCAM的特異性，并比現有抗體Ab4的結合親和力高大約45倍(圖2至3)。而且，由于該抗體識別LlCAM蛋白，它經ADCC表現出對癌細胞的毒性和抗癌作用而沒有體重減輕(圖4至5)。為了進一步改善具有高親和力的Ab4M抗體的親和力，對Ab4M抗體的輕鏈CDR3進行另外的突變以開發出比Ab4M抗體具有更好地改善的親和力的本發明的Ab417抗體。該抗體顯示出其針對人LlCAM的親和力是Ab4M抗體的兩倍，并且它還是高表達的(圖6至7)。另外，發現Ab417抗體識別LlCAM蛋白，從而經ADCC顯示對癌細胞的毒性和抗癌作用而沒有體重減輕(圖8至9)。為了改善Ab417的物理性質或/和生產力，修飾Ab417的重鏈和輕鏈可變區以制備具有R16G、K76A或P88A的重鏈可變區(H6);具有R16G、D54E、K76A和P88A的重鏈可變區(H5);具有I31A的輕鏈可變區(L2);和具有R37Q、R39K和K42Q的輕鏈可變區。檢查了 Ab417_H6L2和Ab417_H5Ll的生產力和物理性質。其結果是，Ab417-H6L2具有與Ab417類似的針對LlCAM的抗原結合親和力并顯示出優異的生產力和物理性質。Ab417-H5L1也具有與Ab417類似的抗原結合親和力并顯示出改善的物理性質(實施例6)。這些結果表明本發明的抗體可以有效用于需要LlCAM識別的領域，例如具有LlCAM過表達的疾病的診斷和治療。
[0075]在另一個方面，本發明提供用于制備所述抗體的方法。
[0076]本發明的抗體可以容易地使用已知的制備抗體的技術進行制備。例如，可以通過利用源自免疫動物的B淋巴細胞制備雜交瘤(Koeher andMilstein, 1976，Nature, 256:495)，或通過使用■菌體展示技術開展單克隆抗體的制備方法，但并不限于此。可以容易地使用已知的制備抗體的技術開展單克隆抗體的制備方法。
[0077]使用噬菌體展示技術的抗體文庫是這樣的方法，其中不制備雜交瘤而從B淋巴細胞直接獲得抗體基因以在噬菌體表面表達抗體。使用噬菌體展示技術能夠避免與由B細胞永生化形成單克隆抗體有關常規困難。一般的噬菌體展示技術包括:I)將具有隨機序列的寡核苷酸摻入對應于噬菌體外殼蛋白PlII (或piv)的N-末端的基因位點；2)表達部分天然外殼蛋白和由具有隨機序列的寡核苷酸編碼的多肽的融合蛋白質；3)處理結合至由所述寡核苷酸編碼的多肽的受體(acceptor) ;4)使用具有低pH或鍵合競爭力的分子洗脫結合至所述受體的肽-噬菌體顆粒；5)在宿主細胞中通過淘選(pann i ng)過程擴增所洗脫的噬菌體；6)重復之前的過程至獲得期望的水平；以及7)鑒定來自通過淘選所選擇的噬菌體克隆的DNA序列的活性肽的序列。
[0078]優選地，使用噬菌體展示技術可以實現本發明的單克隆抗體的制備。本領域技術人員可以參考已知的■菌體展不技術例如Barbas等(METH0DS:A Compan1n to Methodsin Enzymo logy 2:119，1991 和 J.Virol.2001 Jul ;75 (14):6692-9)和 Winter 等(Ann.Rev.1mmunol.12:433，1994)逐步進行本發明的制備方法。構建抗體文庫有用的噬菌體可以是絲狀噬菌體，其可以通過fd、M13、fl、Ifl、Ike、Zj/Z、Ff、Xf、Pfl或Pf3進行例舉，但并不限于此。可以用于在所述絲狀噬菌體表面展示外源基因的載體的例子包括噬菌體載體(fUSE5、fAFFUfd-CATI 和 fdtetDOG)、或噬菌粒載體(pHENl、pComb3、pComb8 或 pSEX)，但并不限于此。被用來提供所需要的重組噬菌體擴增的成功再感染的野生型外殼蛋白的輔助噬菌體可以通過M13K07或VSCM13進行例舉，但并不限于此。
[0079]而且，酵母展示技術是在酵母細胞表面表達蛋白質。由于酵母具有真核蛋白質表達系統，翻譯后修飾發生于由該技術所表達的蛋白質中，從而與使用噬菌體或核糖體展示技術相比獲得更接近于人蛋白質的重組蛋白質。而且，所述酵母展示技術具有以下優點:因為克隆通過FACS(熒光激活細胞分選)進行選擇，克隆選擇和定量分析可以同時進行。一般情況下，scFv抗體的酵母展示技術包括以下步驟:1)經短氨基酸接頭向酵母細胞壁蛋白Aga2p的C-末端插入scFv文庫和標簽序列；2)將Aga2和scFv抗體基因經二硫鍵連接至酵母細胞壁蛋白Agal以在酵母細胞表面表達所述基因；3)將抗原結合至酵母表面所表達的scFv抗體文庫；4)處理能夠特異性識別所述抗原和所述標簽的熒光綴合的二抗；5)通過FACS選擇表達抗原特異性scFv抗體的酵母細胞；以及6)獲得通過FACS所選擇的克隆的DNA序列信息以便確定具有高抗原結合能力的抗體可變區。
[0080]根據本發明的編碼雜交瘤來源的單克隆抗體或噬菌體展示克隆的多核苷酸可以被容易地使用典型的工藝進行分離并測序。例如，可以采用被設計為特異性擴增來自雜交瘤或噬菌體模板DNA的重鏈和輕鏈編碼區的寡核苷酸引物。一旦分離了所述多核苷酸，它可以被插入表達載體，其然后被導入宿主細胞。所得到的宿主細胞(即轉化體)可以生產所關注的單克隆抗體。因此，本發明的人單克隆抗體的制備方法可以包括擴增編碼在攜帶編碼人單克隆抗體的多核苷酸的表達載體中的人單克隆抗體的多核苷酸的步驟，但并不限于此。
[0081]在又一個方面，本發明提供編碼所述抗體的多核苷酸、包括所述多核苷酸的表達載體和導入了所述載體的轉化體。
[0082]所述抗體與如上所述的相同。
[0083]包括編碼本發明中所提供的抗體的多核苷酸的表達載體可以包括但不限于允許所述多核苷酸在真核或原核細胞中的復制和/或表達的載體，所述細胞如哺乳動物細胞(例如人、猴、兔、大鼠、倉鼠、小鼠等)、植物細胞、酵母細胞、昆蟲細胞和細菌細胞(例如大腸桿菌)。優選地，所述載體可以為可操作地連接至合適的啟動子的載體以便誘導所述多核苷酸在所述宿主細胞中的表達，并包括至少一個選擇標記物。例如，所述多核苷酸可以被導入噬菌體、質粒、粘粒、微型染色體、病毒或逆轉錄病毒載體。
[0084]包括編碼所述抗體的多核苷酸的表達載體可以是包括編碼所述抗體各自的重鏈或輕鏈的各自的多核苷酸的表達載體，或包括既編碼所述抗體的重鏈又編碼所述抗體的輕鏈的多核苷酸的表達載體。
[0085]導入本發明中所提供的表達載體的轉化體的例子包括但不限于細菌細胞(如大腸桿菌、鏈霉菌屬、鼠傷寒沙門氏菌)；酵母細胞；真菌(如畢赤巴斯德酵母)；昆蟲細胞(如果蠅屬、夜蛾屬Sf9);動物細胞(如CHO(中國倉鼠卵巢細胞)、SP2/0(小鼠骨髓瘤)、人類淋巴母細胞、COS、NSO(小鼠骨髓瘤)、293T、Bowes黑色素瘤細胞、HT-1080、BHK(幼倉鼠腎細胞)、HEK (人胚腎細胞)和PERC.6 (人視網膜細胞));和植物細胞，其通過導入所述表達載體進行轉化。
[0086]如本文所使用的術語“導入”是指將包括編碼所述抗體的多核苷酸的載體遞送進入宿主細胞。可以使用本領域眾所周知的各種方法進行所述導入，包括磷酸鈣-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介導的轉染、聚凝胺介導的轉染、電穿孔、顯微注射、脂質體融合、脂質體轉染和原生質體融合。轉導是指所期望的物質經病毒顆粒在感染的基礎上被轉移至細胞的過程。此外，可以通過基因轟擊將載體遞送進入宿主細胞。在本發明中，導入與轉化可以互換使用。
[0087]在又一個方面，本發明提供通過將藥物綴合至所述抗體所制備的抗體-藥物綴合物。
[0088]所述抗體與如上所述的相同。
[0089]如本文所使用的術語“抗體-藥物綴合物”是指利用靶特異性、在血液循環過程中沒有毒性和所述抗體的藥物代謝動力學優點，通過將藥物綴合至所述抗體所制備的物質。通常，該抗體-藥物綴合物包括單克隆抗體-接頭-藥物的三個組分，并且該綴合物可以通過將藥物遞送至所述抗體革E向的細胞(特別是癌細胞)提高治療效果。
[0090]如本文所使用的術語“藥物”是指被直接或間接綴合至所述抗體以便實現所述抗體靶向的疾病的治療的物質。能夠結合所述抗體的藥物包括放射性核素、藥物、淋巴因子、毒素和雙特異性抗體。所述放射性核素的例子包括3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、9°Y、1251、m1、186Re，但并不限于此。所述藥物或毒素的例子包括依托泊苷、替尼泊苷、阿霉素、道諾霉素、洋紅霉素、氨基蝶呤、放線菌素D、絲裂霉素、順鉑及其類似物、博萊霉素、埃斯波霉素、5-氟尿嘧啶和美法侖和其它氮芥，但能夠結合本發明的抗體的藥物或毒素并不限于這些例子。
[0091]可以通過本領域已知的各種制備抗體-藥物綴合物的方法制備所述抗體-藥物綴合物。
[0092]在又一個方面，本發明提供包括所述抗體的用于預防或治療癌癥的藥物組合物。
[0093]由于所述抗體以高親和力結合LlCAM蛋白、所述LlCAM蛋白已知在癌癥中過表達并在癌癥的生長和轉移中發揮重要作用，它帶來LlCAM蛋白的抑制、中和或細胞毒性，導致具有LlCAM過表達的疾病的預防或治療。所述抗體與如上所述的相同。
[0094]如本文所使用的術語“癌癥”并不特別限定，只要用本發明的抗體它是可預防的或可治療的。所述癌癥的例子包括膽管癌、食道癌、胃癌、大腸癌、直腸癌、口腔癌、咽癌、喉癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、子宮內膜癌、卵巢癌、前列腺癌、睪丸癌、膀胱癌、腎癌、肝癌、胰腺癌、骨癌、結締組織癌、皮膚癌、腦癌、甲狀腺癌、白血病、霍奇金病、淋巴瘤和多發性髓樣血液癌癥。如本文所使用的術語“預防”是指由于施用所述組合物導致癌癥發作的抑制或延遲的作用，并且術語“治療”是指由于施用所述組合物導致癌癥癥狀的改善或所述癥狀的有益改變的作用。
[0095]所述藥物組合物還可以包括藥學可接受的載體。
[0096]如本文所使用的術語“藥學可接受的載體”是指不會對生物體引起顯著刺激且不會消除所施用化合物的生物活性和性質的載體或稀釋劑。對于液體制劑，所述藥學可接受的載體應當被滅菌并適合活體。例如，它可以包括鹽水溶液、滅菌水、林格氏溶液、緩沖鹽溶液、白蛋白注射液、右旋糖溶液、麥芽糊精溶液、甘油、乙醇或一種或多種以上的成分的混合物。如果必要的話，可以加入其它普通添加劑，如抗氧化劑、緩沖劑、抑菌劑等。另外，還可以加入稀釋劑、分散劑、表面活性劑、粘合劑或潤滑劑以將所述組合物配制成注射制劑(如水溶液、懸浮劑)和乳劑、丸劑、膠囊劑、顆粒劑或片劑。
[0097]所述藥物組合物可以是各種口服或非口服劑型。所述藥物組合物可與稀釋劑或賦形劑(如填料、增稠劑、粘合劑、潤濕劑、崩解劑、表面活性劑等)組合配制。用于口服給藥的固體制劑可以是片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑等的形式。關于這些固體制劑，本發明的化合物與至少一種賦形劑(如淀粉、碳酸鈣、蔗糖、乳糖或明膠)組合配制。除了簡單的賦形劑，可以使用潤滑劑(如硬脂酸鎂、滑石等)。用于口服給藥的液體制劑是混懸液、內服的溶液、乳劑、糖漿劑等。除了簡單的稀釋劑(如水或液體石蠟)，可以在液體制劑中包含各種賦形劑，例如潤濕劑、甜味劑、芳香劑、防腐劑等。另外，本發明的藥物組合物可以是腸胃外劑型如無菌水溶液、非水性溶劑、混懸液、乳劑、凍干制劑、栓劑。丙二醇、聚乙二醇、植物油(如橄欖油)以及可注射酯(如油酸乙酯)可被用于非水溶劑和混懸液。栓劑的基礎材料包括Wit印sol、聚乙二醇、吐溫61、可可脂、月桂脂和甘油明膠。
[0098]所述藥物組合物可以具有選自由片劑、丸劑、粉劑、顆粒劑、膠囊劑、混懸液、內服的溶液、乳劑、糖漿劑、無菌水溶液、非水性溶劑、混懸液、乳劑、凍干制劑和栓劑組成的組的任意一種制劑。
[0099]本發明的組合物以藥學有效量進行施用。
[0100]如本文所使用的術語“藥學有效量”是指以合理的優點/風險比足以治療疾病的量，其可以適用于醫療。有效劑量水平可以根據受試者的種類和嚴重程度、年齡、性別、癌癥的類型、藥物活性、對該藥物的敏感性、施用時間、施用途徑、排泄速率、治療持續時間、或包括同時施用的藥物的元素、或醫療領域中眾所周知的其它元素來確定。本發明的組合物可以單獨施用或與其它治療劑組合施用，或者也可以順序或者同時的方式與常規治療劑一起進行施用。另外，可以單劑量或可被分成多個劑量施用所述組合物。鑒于上述所有因素，以能夠表現出最大效果而不引起副作用的最小量施用所述組合物是重要的，并且其可容易地由本領域技術人員確定。
[0101]在本發明的一個實施方案中，發現作為Ab4抗體的代表性抗體突變體的Ab4M和Ab417有效誘導ADCC并抑制癌癥生長而沒有體重減輕，從而被用于癌癥的預防和治療(圖4、5、8 和 9)。
[0102]在又一個方面，本發明提供使用所述抗體用于治療癌癥的方法。
[0103]所述抗體和癌癥與如上所述的相同。
[0104]所述用于治療癌癥的方法可以是包括給患有癌癥或懷疑患有癌癥的受試者施用包括所述抗體和藥學可接受的載體的藥物組合物的步驟的用于治療癌癥的方法。所述藥學可接受的載體如上所述。所述用于治療癌癥的方法可以優選包括給患有癌癥的受試者施用包括所述抗體的組合物的步驟的用于治療癌癥的方法。
[0105]所述受試者可以是哺乳動物(如牛、豬、綿羊、雞、狗、人等)和鳥，并且它可以包括任何受試者，其癌癥可以通過施用本發明的組合物進行治療，而沒有限制。
[0106]可以藥學有效量以單劑量或多個劑量施用所述組合物。在這方面，可以溶液、粉劑、氣霧劑、膠囊劑、腸溶片或膠囊劑或栓劑的形式施用所述組合物。施用模式包括腹膜內、靜脈內、肌內、皮下、皮內、口服、局部、鼻內、肺內和直腸內，但并不限于此。但是，由于肽在口服施用后被消化，用于口服施用的組合物的活性成分應當被包衣或配制成防止在胃中的降解。此外，可以使用能夠輸送活性成分進入靶細胞的特定裝置施用所述藥物組合物。
[0107]在又一個方面，本發明提供用于給癌癥診斷提供信息的方法，其包括檢測從懷疑患有癌癥的受試者分離的生物樣品中LlCAM蛋白和所述抗體之間的抗原-抗體反應的步驟。該方法也可以是用于診斷癌癥的方法。
[0108]所述抗體、癌癥、受試者和LlCAM蛋白與如上所述的相同。已知LlCAM蛋白在各種癌癥中過表達，并因此本發明的抗體可以被有效用于其中LlCAM蛋白過表達的癌癥的診斷。
[0109]在所述用于給癌癥診斷提供信息的方法中，可以通過將本發明的LlCAM特異性人單克隆抗體與從懷疑患有癌癥的受試者分離的生物樣品反應并且然后檢測抗原-抗體復合體的形成來檢測LlCAM蛋白。因此，可以提供信息用于癌癥診斷。
[0110]詳細地，所述方法可以是提供信息用于癌癥診斷的方法或用于診斷癌癥的方法，包括以下步驟:(a)用所述抗體處理從懷疑患有癌癥的受試者分離的生物樣品以便通過抗原-抗體反應檢測LlCAM蛋白；(b)比較在(a)中與對照組中所檢測的LlCAM蛋白水平，并且當LlCAM蛋白的水平比對照組的高時確定所述受試者為癌