生產蛋白的方法
【專利說明】生產蛋白的方法
[0001] 本發明涉及通過收獲微生物細胞培養液并添加一定量絮凝劑以實現有效粒徑分 布來生產重組蛋白的方法。本發明還涉及通過添加一定量絮凝劑以實現有效粒徑分布來澄 清微生物收獲物的方法。
[0002] 發明背景 重組蛋白的大規模制造是生物技術工業的重要挑戰。重組蛋白通常由宿主細胞培養物 或經由無細胞的系統生產。在每種情況下，將蛋白從包含雜質的樣品純化至足以用作人治 療產品的純度。典型工藝涉及初始澄清以移除固體微粒，隨后純化以確保足夠純度。澄清 可降低對純化期間后續層析步驟的負荷。
[0003] 典型澄清步驟包含離心步驟或過濾步驟或二者。在澄清之前，可使用預處理步驟 作為調節樣品的方法。調節預處理步驟的實例是絮凝，其引起固體微粒形成較大聚集物，隨 后通過澄清移除所述較大聚集物。
[0004] 對使用絮凝劑的許多焦點是增加存在于樣品中的固體微粒的粒徑以改善澄清效 率。這是因為較大聚集物通過離心更易于移除。
[0005] 澄清方法的開發通常涉及選擇有效量的絮凝劑以（i)最大化固體微粒移除、（ii) 保存產品質量和產品回收率、（iii)最小化所用絮凝劑的量（過多會引起渾濁）、（iv)最小 化絮凝劑對后續純化步驟（例如層析步驟）的影響和（V)確保絮凝劑移除至治療產品中的 可接受水平。
[0006] 因此，在選擇有效量的絮凝劑以實現期望效應同時最小化不期望效應時，必須實 現小心平衡。
[0007] 用以測定有效量的絮凝劑的經驗測試通常在澄清和純化工藝的不同階段實施，所 述工藝包括評價以下之一或組合：(a)絮凝物特性，諸如（i)絮凝物的形成（絮凝的起始） 和絮凝物的破裂；（ii)絮凝物大小；（iii)絮凝物的機械穩定性/強度；（iv)絮凝物的表面 剪切抗性；(b)澄清效率；（c)濾過性；和（d)純化。此類經驗測試可耗時且費力。
[0008] 因此，需要生產重組蛋白的微生物細胞收獲物的更有效澄清方法。
[0009] 發明概沐 本發明提供生產重組蛋白的方法，其中所述方法包括： (a) 收獲表達重組蛋白的微生物細胞培養液；和 (b) 添加一定量絮凝劑以實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μπι或更小 的大小范圍內。
[0010] 在另一方面，本發明提供生產重組蛋白的方法，其中所述方法包括： (a) 收獲表達重組蛋白的微生物細胞培養液； (b) 添加一定量絮凝劑以實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μπι或更小 的大小范圍內；和 (C)澄清絮凝收獲物。
[0011] 在另一方面，本發明提供生產重組蛋白的方法，其中所述方法包括： (a)收獲表達重組蛋白的微生物細胞培養液； (b)添加一定量絮凝劑以實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μπι或更小 的大小范圍內； (C)澄清絮凝收獲物；和 (d)從澄清絮凝收獲物純化重組蛋白。
[0012] 在另一方面，本發明提供澄清微生物收獲物的方法，其中所述方法包括： (a) 收獲微生物細胞培養液； (b) 添加一定量絮凝劑以實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μπι或更小 的大小范圍內；和 (C)澄清絮凝收獲物。
[0013] 在又一方面，本發明提供修飾的大腸桿菌細胞收獲物，其中： (a) 細胞表達細胞周質靶向重組蛋白； (b) 收獲物包含0.01-2% PEI ;且 (c) 收獲物的體積粒徑分布為約5%或更少的顆粒在5 μ m或更小的大小范圍內。
[0014] 附圖簡沐 圖1 :顯示DOMlOO收獲物的粒徑分布，其中添加0. 005%、0. 05%、0. 1%、0. 5%和2% PEI。
[0015] 圖2 :Dat06收獲物的直徑等于或小于5 μπι的顆粒的體積％，其中添加0. 03%、 0· 05%、0· 1%、0· 5% 和 2. 0% ΡΕΙ。
[0016] 圖3 :D0M101收獲物（空心圓）和暴露于高剪切的收獲物（閉合圓）的粒徑分布。 大小分布表不為（a)總體積粒徑分布（log標度）；強調峰1 (插圖b)、峰1和2 (插圖c)， 以及峰3 (插圖d)的粒徑分布。
[0017] 圖4 :用0· 5% PEI處理的DOMlOl收獲物（閉合圓）和用低剪切（十字形）和高 剪切（空心圓）處理的PEI絮凝收獲物的粒徑分布。大小分布表示為（a)總體積粒徑分布 (log標度）；強調峰1 (插圖b)、峰1 (插圖c)，以及峰2 (插圖d)的粒徑分布。
[0018] 圖5 :PEI濃度對D0M100微生物培養液收獲物濁度（進料濁度）和離心后濁度（離 心液（centrate)池度）的影響。
[0019] 圖6 :D0M0101收獲物（a)和0. 5% PEI存在下的D0M101收獲物（b)的剩余固體％ 的超比例縮減模型。還代表經受無剪切（閉合圓）、低剪切（十字形）和高剪切（空心圓） 的樣品。
[0020] 圖7 :PEI濃度對D0M100收獲物離心液的主要過濾器容量的影響。
[0021] 圖8 :三種不同絮凝劑對示例性蛋白Dat06和D0M100的收獲物中的DNA濃度的影 響。
[0022] 圖9 :0. 5% PEI對示例性蛋白D0M0101收獲物離心液的濾過性的影響。
[0023] 圖10 :在不同收獲物誘導后時間，有和無0. 5% PEI處理的D0M0101收獲物離心液 的濾過性的Vniax的變化。
[0024] 圖11 :解凍D0M101收獲物（空心圓）和用高剪切處理的解凍收獲物（閉合圓）的 粒徑分布。大小分布表示為（a)總體積粒徑分布（log標度）；強調峰1(插圖b)、峰1、2和 3 (插圖c)，以及峰3和4 (插圖d)的粒徑分布。
[0025] 圖12 :解凍D0M101收獲物（閉合圓）和用高剪切處理的0. 5% PEI解凍收獲物 (空心圓）的粒徑分布。大小分布表示為（a)總體積粒徑分布（log標度）；強調子峰（插 圖b)、峰I (插圖c)、峰1和2 (插圖d)，以及峰2的尾端（插圖e)的粒徑分布。
[0026] 圖13 :在無剪切（閉合圓）、低剪切（十字形）和高剪切（空心圓）存在下用0· 5% PEI處理的解凍DOMlOl收獲物的粒徑分布。大小分布表不為（a)總體積粒徑分布（log標 度）；強調峰1(插圖b)、峰1(插圖c)，以及峰2(插圖d)的粒徑分布。
[0027] 圖14 :用剪切解凍D0M101收獲物（閉合圓）和均質化解凍D0M101收獲物（空心 圓）的粒徑分布。大小分布表示為（a)總體積粒徑分布（log標度）；強調峰1(插圖b)、峰 2和3(插圖c)，以及峰3(插圖d)的粒徑分布。
[0028] 圖15 :解凍D0M101收獲物（a)與添加 PEI (b)和隨后暴露于低剪切（c)或高剪切 (d)的顯微鏡圖像。
[0029] 圖16 :D0M0101均質化解凍收獲物（a)、D0M101解凍收獲物（b)和0. 5% PEI絮凝 D0M101解凍收獲物（c)的剩余的固體％的超比例縮減模型（如圖6的圖注）。
[0030] 圖17 :評價具有0-0. 6%的PEI濃度范圍和pH4-9的pH范圍的DAT06發酵收獲 物的：(A)如于A600nm波長下測量的上清液濁度以評價溶液澄清度（0. 2-2. 0的標度）；和 (B)處理能力，如通過在離心力下穿過0· 2 μ m過濾器的直接過濾性能測量（濾液體積標度 為 0-250)。
[0031] 圖18 :用0· 1% PEI (低絮凝劑濃度）和0· 4% PEI (高絮凝劑濃度）和不同離子強 度（導電率）的NaCl溶液處理Dat06收獲物。〃低絮凝劑〃和〃高絮凝劑〃僅出于比較原 因使用。在A中評價平均顆粒直徑（μ m);且在B中評價彡5 μ m的顆粒的體積％。
[0032] 圖 19 :用 4. 3% CaCl2、0. 1% PEI 和 0· 2% PEI 使 D0M100 收獲物發生絮凝。在 A 中 評價平均顆粒直徑，且在B中評價< 5 μ m的顆粒的體積％(粒徑由空心正方形顯示）。使用 分批離心機和管式離心機（連續離心機）測定過濾器容量。
[0033] 圖20 :將添加0. 4% PEI的Dat06和D0M100收獲物與未用絮凝劑處理的樣品進行 比較。隨后通過離心實施澄清且使用定制分析型免疫分析測量HCP水平。
[0034] 詳沭 本發明涉及以下認識：可通過影響5μπι或以下的顆粒的粒徑分布和比例實現利用絮 凝劑的更有效澄清方法。本發明人已認識到，在絮凝劑添加后，5 μπι或以下的顆粒的比例決 定澄清效率。通過在絮凝劑添加后實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μ m或 更小的大小范圍內而產生更有效澄清方法。
[0035] 使用此方法防止需要費力經驗測試以測定澄清工藝的不同階段時的絮凝劑的有 效量。
[0036] 與未添加絮凝劑或未實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μπι或更 小的大小范圍內的絮凝劑的量相比，本文所述方法在澄清期間離心后產生降低的固體含量 (增加的固體移除）。此離心步驟中的固體的有效移除代表顯著益處，因為改善性能對下游 過濾和/或純化步驟具有放大效應。這也使用特別粘或具有高密度的細胞培養物。這可經 由離心機產生改善的處理時間。
[0037] 與未添加絮凝劑或未實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μ m或更小 的大小范圍內的絮凝劑的量相比，本文所述方法在澄清期間產生改善濾過性。這可產生穿 過過濾器的改善流速。此外，可增加最大過濾器容量。因此，總處理時間減少。由于這些優 勢，可降低過濾器成本。
[0038] 與未添加絮凝劑或未實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μ m或更小 的大小范圍內的絮凝劑的量相比，本文所述方法在澄清期間離心后產生降低濁度。
[0039] 與未添加絮凝劑或未實現如下體積粒徑分布：約5%或更少的顆粒在5 μ m或更小 的大小范圍內的絮凝劑的量相比，本文所述方法產生澄清絮凝收獲物中的降低DNA濃度。
[0040] 與未添加絮凝劑相比，其它改善包括針對在澄清期間的剪切影響的改善的保護。
[0041] 所述改善也適于通過凍融和/或均質化預處理的收獲物。
[0042] 所述方法導致鑒定在澄清期間實現期望效應的絮凝劑的最小有效量。
[0043] 本文所用〃約〃在提及可測量值（例如量、時距等）時，意指涵蓋偏離指定值± 1%、 ±0. 75%、±0. 5%、±0. 25%、±0. 2%和±0. 1%的變化，如同此類變化適于實施所述方法一 樣。
[0044] 重組蛋白 重組蛋白可包含抗原結合蛋白、單克隆抗體、抗體片段或結構域抗體。
[0045] 重組蛋白可包含病毒蛋白、細菌毒素、細菌類毒素或癌癥抗原。例如，細菌類毒素 是白喉類毒素，諸如CRM197 ;或肺炎鏈球菌（SirepiococciAs /we腫o/?iae)莢膜糖綴合物和 包含蛋白E和/或流感嗜血桿菌的PilA的蛋白組分。
[0046] 如本文所用，〃重組蛋白〃是指任何可施用于哺乳動物以誘導組織、系統、動物或 人的生物或醫學反應的蛋白和/或多肽。重組蛋白可誘導多于一種生物或醫學反應。此外， 術語"治療有效量"意指與未接受該量的相應受試者相比，導致，但不限于，治愈、預防或改 善疾病、病癥或副作用或疾病或病癥的進展速率降低的量。該術語在其范圍內還包括有效 增強正常生理功能的量以及在患者中有效引起增強或有助于第二藥劑的治療效應的生理 功能的量。
[0047] 本文所用術語"抗原結合蛋白"是指能夠結合至抗原的抗體、抗體片段和其它蛋 白構建體（諸如結構域）。
[0048] 本文所用術語〃抗體〃在最廣泛含義上是指具有免疫球蛋白樣結構域的分子。 如本文所用，"免疫球蛋白樣結構域"是指保留抗體分子的免疫球蛋白折疊特性的多肽 的家族，其含有兩個β片和通常保守二硫鍵。該家族包括單克隆（例如IgG、IgM、IgA、 IgD或IgE)、重組、多克隆、嵌合、人源化、雙特異性和異源綴合物抗體；單一可變結構域、結 構域抗體、抗原結合片段、免疫有效片段、Fab、F(ab'）2、Fv、二硫鍵連接的Fv、單鏈Fv、雙 鏈抗體、TANDABS ?等（關于替代〃抗體〃形式的概述，參見Holliger和Hudson, Nature Biotechnology, 2005， Vol 23， No. 9， 1126-1136)。
[0049] 短語"單一可變結構域"是指以獨立于不同可變區或結構域的方式特異性結合抗 原或表位的抗原結合蛋白可變結構域（例如，VH、VHH、VJ。可認為"結構域抗體"或"dAb" 與能夠結合至抗原或表位的"單一可變結構域"相同。術語"表位結合結構域"是指以獨 立于不同結構域的方式特異性結合抗原或表