熒光定量pcr檢測核酸分子的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域，特別是涉及一種熒光定量PCR檢測核酸分子的方法。
【背景技術】
[0002] 隨著人類文明持續向前推進，各種病毒接踵而來，從乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV， 到冠狀SARS病毒，再到近年的甲型流感H1N1、H3N2,禽流感H5N1、H7N9、H9N2,手足口病毒 EV71、CA16等，每一次病毒爆發和流行都嚴重威脅到人類的健康，生存及發展，造成重大財 產損失。
[0003] 病毒的檢測是人們在與病毒的斗爭中重要的技術，當前，病毒檢測技術主要包括 病原學、免疫學、分子生物學三個方面。其中，熒光定量PCR檢測具有很高的特異性、靈敏性 和重復性，已廣泛用于甲型流感、禽流感等病毒的診斷。但是，傳統的熒光定量PCR檢測方 法通常以純化的核酸分子（DNA或RNA)為模板，而從樣本中提取核酸分子步驟操作復雜。
【發明內容】
[0004] 基于此，有必要提供一種無需從樣本中提取核酸分子的熒光定量PCR檢測核酸分 子的方法。
[0005] -種熒光定量PCR檢測核酸分子方法，包括如下步驟：
[0006] 針對待檢測樣本中的病毒核酸分子的序列保守區設計特異性擴增引物和探針；
[0007] 將待檢測樣本與蛋白質變性液混合，使得所述待檢測樣本中的病毒核酸分子釋 放，得到混合樣本；
[0008] 將所述混合樣本預熱后與PCR反應預混液混合，得到反應液，所述PCR反應預混液 包括所述特異性擴增引物和所述探針；以及
[0009] 將所述反應液置于熒光定量PCR儀中進行PCR反應。
[0010] 在一個實施例中，所述探針為Taqman探針。
[0011] 在一個實施例中，將所述混合樣本預熱的操作中，所述預熱的溫度為55 °C~ 70°C，所述預熱的時間為IOmin~15min。
[0012] 在一個實施例中，所述蛋白質變性液包括異硫氰酸胍、檸檬酸鈉、十二烷基肌酸 鈉、β-巰基乙醇和蛋白酶K。
[0013] 在一個實施例中，所述蛋白質變性液中，異硫氰酸胍的濃度為0. 2mol/L~2mol/ L，檸檬酸鈉的濃度為lOmmol/L~30mmol/L，十二烷基肌酸鈉的質量濃度為0. 2%~1%， β -疏基乙醇的濃度為0. 05mol/L~0. lmol/L，蛋白酶K的濃度為lmg/mL~5mg/mL。
[0014] 在一個實施例中，所述待檢測樣本與所述蛋白質變性液的體積比為1 :1~2。
[0015] 在一個實施例中，所述PCR反應預混液還包括PCR反應緩沖溶液和反應酶系；
[0016] 所述PCR反應緩沖溶液包括Tris-HCU硫酸銨、氯化鉀、Tween 20和硫酸鎂；
[0017] 所述待檢測樣本中的病毒核酸分子為DNA時，所述反應酶系包括Taq DNA聚合酶、 dNTPs和BSA ;所述待檢測樣本中的病毒核酸分子為RNA時，所述反應酶系包括Taq DNA聚 合酶、dNTPs、BSA、逆轉錄酶和RNasin。
[0018] 在一個實施例中，所述TriS-HCl在所述PCR反應緩沖溶液中的終濃度為IOmmol/ L ~65mmol/L ；
[0019] 所述硫酸銨在所述PCR反應緩沖溶液中的終濃度為lOmmol/L~20mmol/L ;
[0020] 所述氯化鉀在所述PCR反應緩沖溶液中的終濃度為40mmol/L~80mmol/L ;
[0021] 所述Tween 20與所述PCR反應緩沖溶液的體積比為(λ 01~2 :100 ;
[0022] 所述硫酸鎂在所述PCR反應緩沖溶液中的終濃度為2mmol/L~5mmol/L ;
[0023] 所述Taq DNA聚合酶為改良的可抗抑制劑的Taq DNA聚合酶；
[0024] 所述逆轉錄酶為改良的可以提高逆轉錄效率和特異性的逆轉錄酶。
[0025] 在一個實施例中，所述待檢測樣本包括血清、血漿、口鼻腔粘液、尿液和糞便中的 至少一種；
[0026] 所述待檢測樣本中的病毒包括乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠狀SARS病毒、甲型 流感HlNl病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一種。
[0027] 在一個實施例中，所述禽流感病毒為H5N1、H7N9和H9N2中的至少一種；所述手足 口病毒為EV71和CA16中的至少一種。
[0028] 上述熒光定量PCR檢測核酸分子方法，針對待檢測樣本中的病毒核酸分子的序列 保守區設計特異性擴增引物和探針，并將待檢測樣本與蛋白質變性液混合，使得待檢測樣 本中的病毒核酸分子釋放；混合樣本預熱后與PCR反應預混液混合并置于熒光定量PCR儀 中進行PCR反應。該檢測方法不需要以純化的核酸分子（DNA或RNA)為模板，待檢測樣本在 蛋白質變性液的作用下，樣本中的病毒核酸分子釋放，省去了從樣本中提取核酸分子步驟。 同時，PCR反應預混液中含有特異性擴增引物和探針，探針隨病毒核酸分子擴增產生熒光信 號，根據熒光信號可實時檢測PCR過程。與傳統的方法相比，該檢測方法無需從樣本中提取 核酸分子，直接進行熒光定量PCR檢測，具有實驗操作簡單，可縮短檢測周期，節約檢測成 本，易于進行高通量檢測的優點。特別是，當檢測樣本較少時，由于不需要從樣本中提取和 純化DNA，該方法也可實現核酸分子的檢測。
【附圖說明】
[0029] 圖1為一實施方式的熒光定量PCR檢測核酸分子方法的流程圖；
[0030] 圖2a為實施例1中陰性對照和陽性對照的熒光定量PCR檢測圖；
[0031] 圖2b為實施例1中內標的熒光定量PCR檢測圖；
[0032] 圖3a為實施例1中平行檢測10管含相同濃度HBV病毒核酸分子的純核酸的熒光 定量PCR檢測圖；
[0033] 圖3b為實施例1中采用本發明提供的方法平行檢測10管含HBV的樣本的熒光定 量PCR檢測圖；
[0034] 圖4a為實施例1中平行檢測8管含相同濃度HBV核酸分子的純核酸的熒光定量 PCR檢測圖；
[0035] 圖4b為實施例1中采用本發明提供的方法平行檢測8管含HBV的樣本的熒光定 量PCR檢測圖；
[0036] 圖5a為實施例2中陰性對照和陽性對照的熒光定量PCR檢測圖；
[0037] 圖5b為實施例2中內標的熒光定量PCR檢測圖；
[0038] 圖6a為實施例2中平行檢測10管含相同濃度EV71核酸分子的純核酸的熒光定 量PCR檢測圖；
[0039] 圖6b為實施例2中采用本發明提供的方法平行檢測10管含EV71的樣本的熒光 定量PCR檢測圖；
[0040] 圖7a為實施例2中平行檢測8管含相同濃度EV71核酸分子的純核酸的熒光定量 PCR檢測圖；
[0041] 圖7b為實施例2中采用本發明提供的方法平行檢測8管含EV71的樣本的熒光定 量PCR檢測圖。
【具體實施方式】
[0042] 下面主要結合附圖及具體實施例對熒光定量PCR檢測核酸分子方法作進一步詳 細的說明。
[0043] 如圖1所示的一實施方式的熒光定量PCR檢測核酸分子方法，包括如下步驟：
[0044] S110、針對待檢測樣本中的病毒核酸分子的序列保守區設計特異性擴增引物和探 針。
[0045] 引物的設計可遵循以下原則：引物序列可選取待檢測的病毒核酸分子的序列保守 區，不能有堿基變異；檢測mRNA時，為避免基因組的擴增，引物設計最好能跨兩個外顯子； 引物的TM值（解鏈溫度）為60°C左右，上游引物和下游引物之間的TM值相差一般不超過 2°C ;引物長度一般為18~25bp。
[0046] 探針的設計可遵循以下原則：探針位置盡可能地靠近上游引物；探針的TM值為 70°C左右，通常比引物的TM值高5~10°C ;探針長度一般為15~45bp ;探針的5'端應避 免使用G (鳥嘌呤），因為5'的G會有淬滅作用，而且即使是被切割下來還會存在淬滅作用， 影響定量；整條探針中，C(胞嘧啶）的含量要明顯高于G(鳥嘌呤）的含量，因為G含量高 會降低反應效率，這時就應選擇配對的另一條鏈作為探針。
[0047] 一般的，為確保引物和探針的特異性，最好將設計好的序列在序列分析軟件中分 析二級結構，并用Blast分析特異性，如果發現有非特異性互補區，需要重新設計引物和探 針。
[0048] 待檢測樣本中的病毒可以為乙肝病毒HBV、艾滋病毒HIV、冠狀SARS病毒、甲型流 感HlNl病毒、禽流感病毒和手足口病毒中的至少一種。
[0049] 具體的，禽流感病毒可以為H5N1、H7N9和H9N2中的至少一種；手足口病毒可以為 EV71和CA16中的至少一種。
[0050] 具體的，探針可以為帶有焚光基團的物質，如Taqman探針。TaqMan探針是一種寡 核苷酸：5'端標記一個報告焚光基團，3'端標記一個淬滅焚光基團。探針完整時，報告基團 發射的熒光信號被淬滅熒光基團吸收。PCR擴增時，Taq酶的5' -3'外切酶將探針酶切降 解，使報告