檢測東方馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列及其試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一組檢測東方馬腦脊髓炎病毒的TaqMan MGB熒光定量RT-PCR核苷酸序列以及檢測試劑盒，屬于生物技術領域。
【背景技術】
[0002]東方馬腦脊髓炎病毒(Easternequine encephalitis virus, EEEV)屬于披膜病毒科甲病毒屬，是引起東方馬腦脊髓炎的病原體。該病毒主要通過蚊蟲傳播，而且含有病毒的氣溶膠可以通過呼吸道感染人類。東方馬腦脊髓炎是傳染性和致死率很高的人畜共患病，馬屬動物死亡率約20%-30%，個別年份和地區高達70%?80%，人感染EEEV的死亡率為30%?40%。因本病最初在美國東方馬群中流行，并在馬腦中被分離出來，因此得名。
[0003]東方馬腦脊髓炎在我國雖有報道，但少有發生，且基本在偏遠地區。隨著我國馬術運動的發展，國際馬術比賽的日益頻繁，我國進出境馬匹的數量也在不斷增加。為保障我國養馬業的健康發展，保證國際賽事的順利進行，建立快速、敏感、特異的EEEV熒光RT-PCR檢測方法十分必要。本發明針對EEEV NSl基因，篩選高度保守的片段，設計引物探針，建立了 EEEV TaqMan MGB 熒光定量 RT-PCR，。
[0004]中國專利CN 102808043 A公開了一種檢測東部馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列和試劑盒，本發明設計的引物特異性更強，靈敏度更高。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是提供一組新的檢測東方馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列以及檢測試劑盒:
為解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:
本發明提供的檢測東方馬腦脊髓炎病毒的核苷酸序列，針對EEEV的NSl基因，篩選高度保守的片段，設計引物探針。
[0006]正向引物的序列如SEQ ID NO:1 所示；P1:5' -CGATGACGCCCAGAAGCT-3'；
反向引物的序列如 SEQ ID NO:2 所示；P2:5' -CTGCCATTGACGACAATTCG-3'；
熒光探針的序列如 SEQ ID NO:3 所示；Probe:5' -FAM-CTGGTTGGGCTCAAC-MGB-3'； 熒光探針序列的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團MGB。
[0007]本發明還提供一種檢測東方馬腦脊髓炎病毒的試劑盒，由以下組分組成:
1)裂解液；
2)熒光RT-PCR反應液，其中包括:RT緩沖液、MgCL2、dNTP、正義引物、反義引物和熒光探針；
3)反轉錄酶M-MLV；
4)RNA酶抑制劑；
5)TaqDNA聚合酶；
6)DEPC 水； 7)陰性對照:東方馬腦脊髓炎病毒陰性組織樣品；
8)陽性對照:為體外轉錄的cRNA；
其中，正向引物為序列表SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列，反向引物為序列表SEQ IDN0.2所示的核苷酸序列，熒光探針為序列表SEQ ID N0.3所示的核苷酸序列，其5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團MGB ；
熒光RT-PCR反應液包括:1XRT緩沖液、1.5mM MgCL2、0.05mM dNTP、0.4μΜ正向引物、0.4μΜ反向引物和0.2μΜ熒光探針。
[0008]本發明的有益效果是:
利用本發明提供的引物和探針及其制備的試劑盒建立的東方馬腦脊髓炎熒光定量RT-PCR的檢測方法。對建立的方法進行了特異性和敏感性試驗。結果表明，建立的TaqManMGB熒光定量RT-PCR最低可檢測I拷貝的cRNA ;且與馬鼻肺炎病毒(EHV-1 )、馬動脈炎病毒(EAV)、馬流感病毒(EIV，H3N8)、西尼羅病毒(WNV)、西方馬腦脊髓炎病毒(WEEEV)和日本馬腦炎病毒(JEV)不發生交叉反應。所制作的標準曲線在10?16拷貝/ yL濃度范圍內有極好的線性關系，相關系數為0.998，標準曲線方程式為y=40-3.351ogx ;與常規RT-PCR相比，該方法更加快速，特異性和敏感性更高，靈敏度為常規RT-PCR方法的1000倍。結果表明，本發明的引物、探針和試劑盒可以快速、高效、特異、敏感的用TaqMan MGB熒光定量RT-PCR方法檢測東方馬腦脊髓炎。
【附圖說明】
[0009]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細的說明。
[0010]圖1 cRNA 的 RT-PCR 鑒定結果；1，DL2000 DNA Marker ;2_4，cRNA RT-PCR 鑒定產物。
[0011]圖2 Taqman MGB熒光定量RT-PCR檢測EEEV的標準曲線。
[0012]圖3 EEEV熒光定量RT-PCR檢測方法特異性分析。
[0013]圖4 EEEV熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性分析。
[0014]圖 5 EEEV RT-PCR檢測敏感性分析；1.DL2000 Marker ;2_8.1.0XlO6 ?1.0XlO0copies/μ L cRNA RT-PCR 產物，9.空白對照。
[0015]圖6中國專利CN 102808043 A方法的敏感性分析。
[0016]圖7本發明EEEV熒光定量RT-PCR檢測方法敏感性分析。
【具體實施方式】
[0017]實施例1利用本發明的引物和探針，以及試劑盒，建立Taqman MGB熒光定量RT-PCR檢測EEEV的標準曲線
(一)標準陽性模板的制備。
[0018]引物序列為:Tl:5' -GCGACACTGTGCGACCAGAT-3'；
T2:5r -GTATTTGTGTTACGTTGTGT-3'。
[0019]1.1 EEEV基因特異性保守片段的擴增
以 EEEV RNA 為模板，加入 10 μ M Τ1、Τ2 各 I μ L ;5XRT_PCR buffer 5 yL ；2.5mM dNTPI μ L和0.5 μ L Enzyme mix進行RT-PCR擴增。反應條件為50 °C 30 min ；94 °C預變性15 min ；94 °C變性 30 s，56 °C退火 30 s，72 °C延伸 30 s，35 個循環；72 °C延伸 10 min。
[0020]反應完畢，取5 μ L擴增產物，于1%瓊脂糖凝膠在I X TAE電泳緩沖液中以100 V電壓進行電泳，用凝膠成像系統觀察記錄結果。
[0021]1.2 標準陽性模板的制備
用Tl和Τ2引物按照1.1的方法進行RT-PCR擴增，將RT-PCR產物按試劑盒說明書(寶生物工程有限公司)進行切膠回收，連接至PMD20-T載體，轉化大腸桿菌DH5 α感受態細胞，37 °0培養過夜，挑取單個菌落，擴大培養后提取質粒，挑選經PCR鑒定正確的重組質粒，送英駿生物科技有限公司測序。將測序正確的重組質粒命名為PMD20T-EEE。
[0022]選用限制性內切酶油a/將重組質粒pMD20T-EEE進行線性化，并純化回收，用SP6RiboMa