引物組、試劑盒及其在hpv全基因組檢測中的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及病毒檢測領域，具體的，本發明涉及一組引物、該組引物在HPV基因組 的擴增和/或HPV的檢測中的用途、一種試劑盒、該試劑盒在HPV基因組擴增、HPV分型和/ 或HPV檢測中的用途，以及一種獲得HPV全基因組序列的方法。
【背景技術】
[0002] 宮頸癌是世界上第三大常見女性腫瘤，并且86%病例發生在發展中國家[Arbyn MjCastellsague X, de Sanjose S, Bruni L, Saraiya M, Bray F, FerlayJ:Worldwide burden of cervical cancer in 2008. Ann 0ncol2011, 22:2675 - 2686·]。據世界范圍內統計，每年 大約有46萬左右新發病例，有超過20萬的婦女死于宮頸癌，世界每年發病的75-80%在發 展中國家，中國由于人口眾多，每年新發病例超過13萬之多，占到世界發病的25%，且近年 來處于增長趨勢，在廣大農村地區增高趨勢更加明顯，并呈現發病年齡提前的現象[開麗 比努?依馬木，馬彩玲.宮頸癌的診斷治療進展[J].地方病通報，2006, 21 (6) :62-65.]。
[0003] 1977年ZurHause首先提出人乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV)是宮頸癌 致病因素的假設；1992年，世界衛生組織（WHO)宣布人乳頭瘤病毒是引起宮頸癌變的首要 因素；1995年，國際癌癥研宄署（IARC)專題討論會將HPV感染確定為宮頸癌的主要病因， 明確宮頸癌是一種感染性疾病。HPV感染是宮頸癌發生的主要因素。
[0004] 人乳頭瘤病毒是乳多空病毒科（Papovaviridae)A亞群內的一組DNA病毒，無包 膜，相對分子質量為5X106。基因組呈雙鏈閉環狀，含有7900對堿基。人乳頭狀瘤病毒是 一個全球范圍來，廣泛傳播的DNA病毒，主要感染人的粘膜及皮膚。研宄表示99. 7%的宮頸 癌組織中可以檢測到HPV病毒。
[0005] HPV雙鏈環狀基因組DNA，主要包括四個部分，早期區域，晚期區域，上游調控區 和在E5及L2之間極短的高突變率的非編碼區。乳頭狀瘤病毒進化速度緩慢，以每年 2±0. 5X KT8個堿基突變頻率進行。同時進化過程也呈現出組織及宿主特異性，導致HPV 基因組多態性在進化過程中，只隨機發生在各型別少數病毒亞型內[Bernard H U，Burk R D, Chen Z, et al. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189PV types and proposal of taxonomic amendments (J) · Virology, 2010, 401(I):70-79. ]〇
[0006] 現有研宄表明，HPV致病分子機制是病毒基因組DNA的復制和表達，其中 早期基因區El、E2、E4、E5、E6和E7轉錄是HPV在宿主細胞增殖的關鍵步驟[IARC Working Group on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. IARC Monographs on the evaluation of carcinogenic risks to humans[M]. World Health Organization，2007.]，目前對于HPV與宮頸癌發生的研宄僅局限在高危型HPV型別之間， 很少探討亞型致癌性的不同。
[0007] HPV檢測廣泛用于HPV相關惡性病變的自然史和病因學研宄。傳統方法主要是 通過形態學和免疫學對其進行檢測。前者包括巴氏涂片細胞學檢測、陰道鏡檢查、宮頸活 檢組織病理學檢查、電鏡技術（直接觀察病毒顆粒）、宮頸攝像檢查以及宮頸熒光檢查等。 后者包括應用免疫組化法通過抗LI蛋白與外殼蛋白反應檢測HPV、采用放射免疫沉淀法 測定宮頸上皮細胞內瘤變（CIN)和宮頸癌患者血清中的HPV16抗體水平、用血清免疫吸附 試驗（ELISA)檢測血清中的HPV E6、E7特異性抗體蛋白等[Sehr P，Zumbach K，Pawlita M. A generic capture ELISAfor recombinant proteins fused to glutathione S-transferase: validation for HPV serology[J].Journal of immunological methods，2001，253 (I) : 153-162.]。傳統方法的特異性和靈敏度不夠理想，存在較高的假陰 性率和假陽性率，且不便于對HPV進行分型，因而目前HPV的主要實驗或診斷技術是應用分 子生物學方法進行HPV-DNA檢測。
[0008] 目前所使用的HPV-DNA檢測方法主要是使用聚合酶鏈式反應目前常用類型包括： 通用引物PCR、型特異PCRCType-Specific PCR)和實時熒光定量PCR。但這些方法都只基 于不同亞型的某部分基因組區域（多數為100-500bp左右）進行分型檢測。
【發明內容】
[0009] 本發明旨在至少解決現有技術中存在的技術問題之一或者至少提出一種商業手 段。
[0010] 依據本發明的第一方面，本發明提供一組引物，該組引物能夠特異性的結合不同 型別的HPV，該組引物包含選自SEQ ID NO :1-28的14對引物中的至少2對，所稱14對引 物的序列分別如 SEQ ID NO :1 和 2、SEQ ID NO :3 和 4、SEQ ID NO :5 和 6、SEQ ID NO :7 和 8、SEQ ID NO :9 和 10、SEQ ID NO :11 和 12、SEQ ID NO :13 和 14、SEQ ID NO :15 和 16、SEQ ID NO :17 和 18、SEQ ID NO :19 和 20、SEQ ID NO :21 和 22、SEQ ID NO :23 和 24、SEQ ID NO :25和26以及SEQ ID NO :27和28所示。在本發明的一些實施例中，該引物組包含選自 SEQ ID NO :1-28的14對引物中的至少3對、至少4對、至少5對、至少5對、至少7對、至少 8對、至少9對、至少10對、至少11對、至少12對、至少13對引物或者全部14對引物。在 本發明的一個實施例中，該組引物還包括序列如SEQ ID NO :29和30所示的一對引物。該 組引物是發明人經過大量序列設計和大量試驗篩選組合，確定下來的能夠分別特異性的識 別不同型別的HPV的引物，并且，該組引物能夠在同一反應體系下互不干擾的特異性結合 到各自的目標模板上，在同一反應體系中特異性擴增出多個型別的HPV全基因組序列。 [0011] 依據本發明的第二方面，本發明提供一種前述任一實施例中的一組引物在HPV基 因組的擴增和/或HPV的檢測中的用途。利用前述本發明一方面或者任一實施例中的這組 引物，能夠對 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、 HPV59和/或HPV66進行全基因擴增及全基因分型。既能快速對HPV病毒進行檢測，同時也 能對其基因組各種特性進行分析。
[0012] 依據本發明的第三方面，本發明提供一種試劑盒，其包含前述任一實施例中的一 組引物。該該試劑盒包含的引物是發明人經過大量序列設計和大量試驗篩選組合，確定下 來的能夠分別特異性的識別不同型別的HPV的引物，并且，該引物能夠在同一反應體系下 互不干擾的特異性結合到各自的目標模板上，在同一反應體系中擴增出多個型別的HPV全 基因組序列。
[0013] 依據本發明的第四方面，本發明提供一種前述試劑盒在HPV基因組擴增、HPV分型 和/或HPV檢測中的用途。利用前述本發明這一方面的試劑盒，利用其所包含的引物，能夠 對 HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59 和/或HPV66進行全基因擴增及全基因分型。既能快速對HPV病毒進行檢測，同時也能對 其基因組各種特性進行分析。
[0014] 基于一種能夠對HPV病毒全基因組信息的檢測方法將會更加有利于進行HPV病毒 的鑒定及分型檢測，有助于對型間變異體的檢測，有助于對于宮頸癌患者病情發展的預期， 有助于更好的輔助指導臨床策略。而且，HPV病毒基因組技術，也能夠給HPV疫苗的研制、 HPV感染的防治提供更多有效的意見，并且隨著對HPV病毒基因組了解的深入，HPV全基因 組技術可能有助于提供給患者個性化的醫療意見。本發明針對目前缺乏一種能對HPV病毒 全基因組進行檢測方法，提供一種檢測HPV全基因組的方法。
[0015] 檢測HPV全基因組，需要獲得HPV全基因組序列，依據本發明的第五方面，本發明 提供一種獲得HPV全基因組序列的方法，該方法包括以下步驟：從待測樣品中獲得核酸；利 用上述本發明一方面或者任一實施例中的一組引物擴增所述核酸，獲得擴增產物；對擴增 產物進行序列測定，獲得測序數據，測序數據包括多個讀段；基于測序數據，獲得HPV全基 因組序列。所說的測序數據可以通過對核酸序列進行測序文庫制備、上機測序獲得，在本發 明的一個實施例中，獲取所述測序數據，包括：制備所述核酸的測序文庫，對所述測序文庫 進行測序。測序文庫的制備方法根據所選擇的測序方法的要求進行，測序方法依據測序平 臺的不同可選擇但不限于Illumina公司的Hisq2000/2500測序平臺、Life Technologies 公司的Ion Torrent平臺和單分子測序平臺，測序方式可以選擇單端測序，也可以選擇雙末 端測序，獲得的下機數據是測讀出來的片段，稱為讀段（reads)。在本發明的一個實施例中， 在獲得擴增產物之后，包括：電泳檢測所述擴增產物，依據所得的電泳檢測結果進行HPV分 型，具體的，可以先利用通用引物例如利用SEQ ID NO :29和30,對獲得的核酸進行第一擴 增，電泳檢測第一擴增是否有產物，即看電泳圖譜上是否有擴增產物條帶，若有條帶說明該 樣品核酸中有