一種檢測人類PDGFRα基因P653L突變的診斷試劑盒和方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種檢測人類I3DGFRa基因 P653L突變的診斷試劑盒。
【背景技術】
[0002] 胃腸道間質瘤（Gastrointestinal Stromal Tumors, GIST)是一類起源于胃腸道 間葉組織的腫瘤，占消化道間葉腫瘤的大部分。胃腸道間質瘤占胃腸道惡性腫瘤的1~ 3%，估計年發病率約為10 - 20/100萬，多發于中老年患者，40歲以下患者少見，男女發病 率無明顯差異。GIST大部分發生于胃（50~70%)和小腸（20~30%)，結直腸約占10~ 20%，食道占0~6%，腸系膜、網膜及腹腔后罕見。GIST病人20-30%是惡性的，第一次就 診時約有11~47%已有轉移，轉移主要在肝和腹腔。
[0003] 目前臨床上一線靶向藥物是格列衛（伊馬替尼，諾華制藥），二線藥物索坦（舒尼 替尼，輝瑞制藥）每個患者年消費均為十余萬人民幣。不同基因突變類型患者，輔助治療的 獲益存在差異，因此靶向治療之前需進行基因檢測，以預測靶向治療的療效并指導靶向藥 物種類和劑量的選用。其規范的用藥方案已經進入《中國胃腸間質瘤診斷治療共識》（2013 年版）。
[0004] 人類roGFRa基因是編碼血小板源性生長因子家族中的一個細胞膜酪氨酸激酶 受體的基因，其突變與GIST相關。TOGFRa基因 P653L突變屬于TOGFRa第14外顯子上 的突變位點，其與GIST的治療相關，出現了該突變的病人，對GIST的一線藥物一一格列衛 敏感，可以采用一線藥物治療有效，而未突變的患者則對一線藥物不敏感，應當采用二線藥 物--索坦治療。因此，檢測GIST患者是否出現TOGFRa基因 P653L突變，對其臨床用藥 有非常重要的意義。
[0005] 但是，目前均是通過測序的方式檢測I3DGFRa基因 P653L突變，但是測序的成本太 高，不利于普通的臨床檢測。
【發明內容】
[0006] 為了解決上述問題，本發明提供了一種新的定量PCR檢測檢PDGFRa基因 P653L 突變的的試劑盒和方法。
[0007] I3DGFRa基因 P653L突變的信息如下：
[0008]
[0009] 本發明提供了 SEQ ID NO. 1~2所示的引物對。
[0010] 本發明提供了 SEQ ID NO. 3所示的探針。
[0011] 本發明還提供了 SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3所示的探針在制備檢測檢測人 類TOGFRa基因 P653L突變的試劑中的用途。
[0012] 優選地，所述試劑還包括SEQ ID NO. 4~5所示引物對與SEQ ID NO. 6所示的探 針和/或SEQ ID NO. 7~9所示引物與SEQ ID NO. 10所示的探針。
[0013] 本發明還提供了一種檢測人類TOGFR a基因 P653L突變的試劑盒，它包括SEQ ID NO. 1~2和SEQ ID NO. 3所示的探針。
[0014] 優選地，
[0015] 它還包括質控引物與質控探針：SEQ ID NO. 4~5所示引物對與SEQ ID NO. 6所 示的探針和/或SEQ ID NO. 7~9所示引物與SEQ ID NO. 10所示的探針。
[0016] 本發明還提供了一種檢測人類I3DGFRa基因 P653L突變的方法，它包括如下步 驟：
[0017] (1)提取樣本DNA :取待檢組織，提取其中的DNA ;
[0018] (2)基因擴增：用前述的試劑盒對待檢樣本中的DNA進行擴增；
[0019] (3)結果檢測：對DNA擴增結果進行檢測。
[0020] 本發明提供的試劑盒可以準確檢測人類I3DGFRa基因 P653L突變，檢測快速、簡 便，成本低廉，可以大量推廣使用，臨床應用前景良好。
[0021] 顯然，根據本發明的上述內容，按照本領域的普通技術知識和慣用手段，在不脫離 本發明上述基本技術思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0022] 以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發明的上述內容再作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發明上述內容 所實現的技術均屬于本發明的范圍。
【附圖說明】
[0023] 圖1樣品1的測序檢測結果
[0024] 圖2樣品2的測序檢測結果
[0025] 圖3樣品1的本發明檢測結果
[0026] 圖4樣品2的本發明檢測結果
[0027] 圖5靈敏度檢測結果
【具體實施方式】
[0028] 實驗試劑：
[0029] Roche 公司
[0030] FastStart Taq DNA Polymerase
[0031] Cat No. 12 032 937 001
[0032] 大連Takara公司
[0033] Uracil DNA Glycosylase(UNG), heat labile 200U 2u/l
[0034] Cat No. 2820
[0035] 大連Takara公司
[0036] dU plus dNTP Mixture(12. 5X)
[0037] (dATP 2. 5mM, dGTP 2. 5mM, dCTP 2. 5mM, dUTP 7. 5mM,)
[0038] Cat No. 4035
[0039] 大連Takara公司
[0040] Takara Taq TM Hot Start Version
[0041] Cat No. R007A
[0042] 實施例1本發明檢測試劑盒和檢測方法
[0043] -、本發明試劑盒的組成
[0044] PCR擴增試劑（50人份）：
[0045]
[0046] PDGFRa基因 P653L突變的擴增引物以及檢測探針：
[0047] 引物：
[0048] F5' -CGG CCA GAT CCA GTG AA-3' Forward(SEQ ID NO. 1)
[0049] R5,-AGC AAG TTT ACA ATG TTC AAA TGT A-3' Reverse(SEQ ID NO. 2)
[0050] 探針：
[0051] Probe FAM-5' -CCCAGGTGAGTCATTATCTTCAGTTCAGAC-3' -BQl Reverse(SEQ ID NO. 3)
[0052] 質控引物和探針：
[0053] 引物：
[0054] CtlF 內 5,-cctcaagatcatcagcaatgcctc-3， Forward(SEQ ID NO. 4)
[0055] CtlR 內 5,-GTG GTC ATG AGT CCT TCC ACG ATA-3' Reverse(SEQ ID NO. 5)
[0056] 探針：
[0057] CtlP 內 HEX-5,-TGG CCA AGG TCA TCC ATG ACA ACT-3,-BQl Forward(SEQ ID NO. 6)
[0058] 引物：
[0059] CtlFl 外 5,_aa ggt gat cta ttt ttc cct ttc t_3， Forward(SEQ ID NO. 7)
[0060] CtlF2 外 5,-acaggtaaccatttatttgttctc-3' Forward(SEQ ID NO. 8)
[0061] CtlR 外 5,-CAA AAC AAA GGA AGC CAC TG-3' Reverse(SEQ ID NO. 9)
[0062] 探針：
[0063] CtlP 外 FAM-5' -TGGGTACACATAACAGTGACTTTAAGGAAC-3' -BQl Forward(SEQ ID NO. 10)
[0064] 二、采用本發明試劑盒檢測
[0065] 1、樣本DNA提取：可以使用Qiagen公司、天根公司、Promega公司等DNA提取試劑 盒提取。
[0066] 以石賭組織樣本，用Qiagen公司試劑盒為例，提取DNA。
[0067] 1.利用手術刀取出組織邊界無用的石蠟；
[0068] 2.將石蠟包埋組織切成4 μ m厚的薄片；
[0069] 3.迅速用滅菌小鑷子取2 -6枚裝入DNase/RNase Free EP管中（每張攤開面積 500 (最大）mm2，即邊長I. 6cm的正方形大小；
[0070] 4.加入800 μ 1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離心3分鐘；
[0071] 5.加入800 μ 1二甲苯，振蕩器上震蕩10s，最大轉數離心3分鐘；
[0072] 6.棄二甲苯，加入800 μ 1無水乙醇，最大轉數離心3分鐘；
[0073] 7.棄無水乙醇，揮干樣品；
[0074] 8.加入 180 μ I ALT buffer 及 20 μ I proteinase K，56°C-小時以上，直至清亮；
[0075] 9. 90°C-小時；
[0076] 10.離心6000g lmin，取上清；（此步驟是防止沉淀物阻塞柱子）
[0077] 11.加入200 μ I AL,混勻，加入200 μ 1乙醇，再混勻；
[0078] 12.簡單離心清潔管壁；
[0079] 13.將全部混合液加入到DNA分離柱，關蓋，離心6000g lmin，換新的收集管；
[0080] 14.加入 500 μ I AW1, 6000g 離心 Imin ;換收集管；
[0081] 15.加入 500 μ1 AW2,6000g 離心 lmin，換收集管；
[0082] 16.全速離心3min，干燥柱子；
[0083] 17.換一只干凈的I. 5ml收集管，準備收集DNA ;加入20-30 μ I ATE，在室溫保持 Imin以溶解DNA。全速離心Imin收集DNA。
[0084] 2、定量PCR擴增
[0085] I3DGFRa基因 P653L突變的擴增引物以及檢測探針：
[0086] F 5' -CGG CCA GAT CCA GTG AA-3' For