九種人肝cyp450酶體外抑制效應快速篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及人肝CYP450酶體外抑制效應快速篩選的方法，具體涉及采用特異性 探針底物表征酶活性，利用體外混合探針底物法（N-in-one)與LC-MS/MS聯用同時測定多 種特異性代謝產物，進而判別九種人肝CYP450酶活性變化，并以此作為體外代謝酶抑制效 應的評判依據。
【背景技術】
[0002] 長期以來，在藥物安全性評價中細胞色素 P450s酶系（CYP450)在藥物代謝和藥物 代謝性抑制相互作用中占據了重要地位。在新藥研發的早期階段利用體外實驗數據盡早預 測新化學實體（NCEs)在體內潛在的藥物相互作用，獲取相關代謝信息，可以有效地提高新 藥篩選的成功率，減少開發成本。
[0003] 體外混合探針底物法（N-in-one)與LC-MS/MS方法聯用在新藥研發早期快速評價 NCEs對CYP450抑制相互作用中得到了廣泛應用。混合探針底物法，也稱Cocktail探針底 物法，即一次實驗給予兩種或兩種以上經不同酶代謝的底物，同時得到多個酶活性信息，加 之高靈敏、高選擇性的LC/MS/MS技術，實現了對多種探藥代謝物的同時檢測，即同時監測 多個CYP450亞型酶活變化，從而提高篩選通量，提高效率，降低成本。在新藥開發早期階段 使用N-in-one技術一直存在爭議，原因在于采用此法需要考慮多種因素的影響，包括探針 底物選擇、避免底物間相互作用、孵育體系輔因子優化等等。而目前報道的方法仍存在不同 程度的缺陷，如忽略底物之間的相互作用，將不同亞型的底物置于同一體系中孵育，從而導 致假陰性結果的發生。
[0004] 混合探針底物法一般選取一種特異性探針底物表征酶活性，但CYP3A4 (ArCh BiochemBiophys，2001，391(l) :49-55)和 CYP2C9(Nature，2003,424(6947) :464-468)等 亞型因存在多個結合位點，故有必要選擇多個結構不相關的底物表征酶活性。近年來不斷 有CYPs同工酶被發現具有抑制效應的底物依賴性，如CYP2C8 (Drug Metab Dispos，2011， 39(9) :1546-1554)、CYP2C9 (Drug Metab Dispos，2009,37(l) :59-65)、CYP2C19 (Drug Metab Dispos，2008,36(3) :523-528)、CYP2D6 (Drug Metab Dispos，2012,40 (I) :47-53) 等。因此，在藥物抑制相互作用的體外評價中，尤其是CYP2與CYP3,盡可能選擇兩種或者 兩種以上結構不相關的探針底物表征代謝酶活性，以提高體外結果的可靠性以及體內預測 的準確性。
[0005] 同一孵育體系中的不同底物之間可能存在藥物相互作用，如CYP2B6探針底物安 非他酮對CYP2C19介導的美芬妥英羥化代謝、CYP2D6介導的右美沙芬-0-脫甲基代謝有抑 制作用（Drug Metab Dispos，2000,28(10) :1176-1183)，CYP1A2 探針底物非那西丁在高濃 度下可抑制CYP2C9介導的甲苯磺丁脲羥化代謝（Drug Metab Lett，2011，5(l) :17-24)。提 示在進行體外混合探針底物共溫孵時須避免同時應用此類存在相互作用的底物，或降低底 物濃度或采取分組策略。
[0006] 近年來，"BSA(牛血清白蛋白）效應"在校正體外酶動力學參數方面的報道越來越 多，成為體外-體內相關性預測的熱門話題，用BSA矯正后的體外表觀IUt進行體外-體 內相關性分析所得到的體內肝清除率更接近于藥物實測值（2~5倍）。Rowland等（J Pharmacol Exp Ther，2007,321 (l) :137-147)研宄發現生物膜在體外37°C孵育過程中會釋 放出一些抑制CYPs活性的長鏈不飽和脂肪酸（如油酸、亞油酸、花生四烯酸等），而BSA的 加入可以封閉這些不飽和脂肪酸在孵育過程中自生物膜的脫落，逆轉抬高了的心值，俗稱 "BSA效應"。這種"BSA效應"還存在底物選擇性和酶選擇性。而目前尚無在混合探針底物 體系中納入BSA作為輔因子的報道。另外，多種有機溶劑及緩沖液對酶活性的影響亦不同。
【發明內容】
[0007] 本發明需要解決的技術問題是：選用多種不同探針底物表征代謝酶活性，并綜合 考慮緩沖液、有機溶劑、輔因子對酶活性的影響及底物相互作用等因素，優化混合探針底物 孵育體系，以用于新藥研發早期的代謝酶抑制效應快速篩選。
[0008] 為解決上述問題，本發明提供如下技術方案，包括：
[0009] 底物選擇：依據各亞型酶特性選擇一種或多種探針底物表征酶活性。
[0010] 緩沖液考察：分別考察在TriS-HCl緩沖體系和PBS緩沖體系中CYP450各亞型酶 活性。
[0011] 溶劑效應考察：考察孵育體系中有機溶劑（甲醇、乙腈）的比例為〇. 5%和1 %時， 對各亞型酶活性的影響。
[0012] BSA效應考察：分別考察加入不同濃度BSA(0. 5%，1%，2% )與不加 BSA相比，各 亞型酶的活性變化。
[0013] 底物相互作用考察：據報道，CYP2B6探針底物安非他酮抑制CYP2C19介導的美芬 妥英羥化代謝和CYP2D6介導的右美沙芬去甲基化代謝。由于安非他酮Km值（67-168 μ M) 較高，故考察安非他酮（〇,5，10μΜ)對CYP2C19的另一底物奧美拉唑、CYP2D6的另一底物 丁呋洛爾是否存在抑制作用。
[0014] 樣品孵育、處理及測定：將不同亞型特異性探針底物根據上述溶劑效應、緩沖液、 BSA效應以及底物相互作用等進行分組孵育20min后，冰浴終止反應并加入含內標的沉淀 劑，離心后取各組上清等體積混勻后LC-MS/MS測定。
[0015] 本發明的有益效果：
[0016] 本發明所建立的方法綜合考慮了底物的選擇、底物之間的相互作用、緩沖液、有 機溶劑以及一些溫孵系統輔因子對酶活性的影響等，希望降低體外混合探針底物法預測 藥物相互作用的假陰性發生率，提高預測結果的準確性；且能同時篩選化合物對九種主要 CYP450亞型的抑制效應，提高了篩選通量。
【附圖說明】
[0017] 圖I !Tris-HCl緩沖體系和PBS緩沖體系中酶反應活性比較
[0018] 圖2 :有機溶劑甲醇、乙腈對主要CYP450酶活性的影響
[0019] 圖3 :BSA對不同底物表征的代謝酶反應速率影響
[0020] 圖4 :安非他酮對丁呋洛爾和奧美拉唑表征的代謝酶反應速率影響
【具體實施方式】
[0021] 本發明通過下面的實施例進行詳細的解釋，但并不意味著本發明僅限于此。
[0022] 1底物選擇
[0023] 如前所述，混合探針底物法通常選取一種特異性探針底物表征酶活性，但對于 CYP3A4和CYP2C9等存在多個結合位點的亞型而言，應選擇多個結構不相關的底物表征酶 活性。除多結合位點現象外，CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6等亞型還存在抑制效應的 底物依賴性。因此，本發明所建立的篩選方法中，尤其對于CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6與 CYP3A4,選擇兩種或者兩種以上結構不相關的探針底物表征代謝酶活性（詳見表1)，以提 高體外結果的可靠性以及體內預測的準確性。
[0024] 表1九種主要CYP450酶亞型及其所選特異性探針底物
[0025]
[0026] 2體外孵育體系優化
[0027] 2. 1實驗材料
[0028] 人肝微粒體（HLM)購自瑞德肝臟疾病研宄（上海）有限公司，微粒體蛋白濃度 為 10mg/500 μ 1。Na2HPO4 · 12H20、NaH2PO4 · 2H20、KCl、MgCl2 · 6H20 購自南京化學試劑 有限公司，Tris-base購自Biosharp公司；煙酰胺腺嗓呤二核苷酸磷酸（NADP+)、6_磷 酸葡萄糖（G-6-P)、6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH)、牛血清白蛋白（BSA)、鄰甲苯海拉 明（mephenamine)購自Sigma公司。甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）購自Merck公 司。特異性探針底物非那西丁（phenacetin)、香豆素（coumarin)、紫杉醇（paclitaxel)、 甲苯橫丁脈（tolbutamide)、美芬安英（S-Mephenytoin)、奧美拉挫（omeprazole)、 丁 呋洛爾（bufuralol)、氯挫沙宗（chlorzoxazone)、尼非地平（ni6edipine)購自 Sigma-Aldrich (St. Louis，M0，USA);安非他酮（bupropion)購自 Toronto Research Chemicals (Toronto，Canada);雙氯芬酸（diclofenac)、右美沙芬（dextromethorphan) 購自 damas_beta(Adamas Reagent Co. Ltd);睪酮（testosterone)購自 International Laboratory USA;咪達挫侖（midazolam)購自中國藥品生物制品檢定所。
[0029] 磷酸鹽緩沖液（PBS) :0.1 M KCl-磷酸鹽緩沖液：含 0.1 M KC1、0.1 M Na2HP04、0.1 M NaH2PCM ;pH = 7. 4。
[0030] Tris-HCl 緩沖液：含 Tris-base 0· 1M，pH = 7· 5〇<