一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子快速制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種海洋生物活性多肽的制備方法，尤其涉及一種赤魟軟骨多肽類血 管生成抑制因子快速制備方法。
【背景技術】
[0002] 腫瘤的生長和轉移都依賴于新生血管的生成，采用抗血管療法治療腫瘤具有高 效、低毒、不易產生耐藥性的優點。因此，尋找活性顯著地血管生成抑制因子成為抗腫瘤藥 物的研宄熱點。腫瘤血管生成受多種因子影響，而血管內皮生長因子（VEGF)是最重要的 血管生成因子，也是內皮細胞VEGF信號轉導的主要執行者，直接參與新生血管形成過程。 研宄表明VEGF必須通過與位于細胞膜上的特異性受體VEGFR-2結合來發揮作用，因而以 VEGFR-2為靶點進行藥物篩選成為抗腫瘤血管生成的重要策略。
[0003] 制備和篩選方法在抗腫瘤藥物研宄中非常重要，而常規的方法費時長，所得到的 活性物質假陽性率高，而比較理想的制備和篩選方法應是將制備方法和篩選方法有效結 合，最大限度地保證抗腫瘤藥物研發的成功率。
[0004] 軟骨魚軟骨富含多種抗腫瘤活性物質，主要包括血管生成抑制因子、抗腫瘤因子 和抗入侵因子，但目前尚未得到有效利用。雖已有報道從赤魟、孔鰩等軟骨中制備血管生成 抑制因子，但得到的活性物質因為分子量大，含量低，而難以進行藥物開發。
[0005] 基于以上現狀，本發明以赤魟軟骨為材料，采用酶解和細胞膜色譜技術建立了腫 瘤血管生成抑制因子的快速制備方法，并提供一種活性顯著的赤魟軟骨多肽類血管生成抑 制因子。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題是提供一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的快 速制備方法。
[0007] 本發明為解決上述技術問題所采取的技術方案為：一種赤魟軟骨多肽類血管生成 抑制因子的快速制備方法，其包括以下步驟： 1) 細胞膜懸液的制備：取血管內皮生長因子特異性受體（VEGFR)高表達的、處于對數 生長期的腫瘤細胞，采用MEM培養基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % 0)2培養箱內培養。 當細胞計數達到IO5~IO7時，應用胰蛋白酶將細胞消化下來，于4°c、1000 r/min離心10~ 15 min，取沉淀用生理鹽水清洗2次后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超聲25~30 min 破碎細胞，將懸液于1000 r/min、4°C條件下離心5~10 min，取上清液于12000 r/min、4°C 條件下離心20~25 min，得細胞膜沉淀，用生理鹽水重懸，清洗2~3次后，加入生理鹽水 至膜蛋白含量為2. 0~2. 3 mg/mL，即為細胞膜懸液； 2) 細胞膜固定相的制備：取預處理的大孔球形硅膠加入到低溫（4°C)反應管中，在振 蕩條件下，按照固液比Ig :25~30 mL將細胞膜懸液加入到反應管中，吸附15~20 h，超 聲研磨20~25 min后，于4000 r/min離心10~15 min，收集沉淀，用生理鹽水洗絳2~ 3次，除去未結合的細胞膜，得細胞膜固定相； 3) 赤魟軟骨蛋白的制備與酶解：將破碎勻漿的赤魟軟骨按固液比I g:10~15 mL加入 到1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，4 °C、振蕩抽提44~48 h后，于4 °C、10000 r/min離心15~ 20 min，取上清液裝入截留分子量為I kDa的透析袋中，用雙蒸水于4 °C以下透析22~24 h，透析液冷凍干燥，得赤魟軟骨蛋白；將赤魟軟骨蛋白按固液比I g :15~20 mL加入到巴 比妥鈉-鹽酸緩沖液（pH 7. 0)中，按照赤魟軟骨蛋白質量的1. 5~2. 5%加入中性蛋白酶 (酶活力彡1.0XlO5 U/g)，酶解溫度55~65 °C，酶解3~4 h，將溶液升溫至90~95°C， 并于此溫度保持10~15 min，溫度降至35~40 °C，用NaOH調pH至7. 5~8. 0,按照赤 魟軟骨蛋白質量的1.5~2. 5%加入胰蛋白酶(酶活力彡1.9X IO4 U/g)，酶解溫度為35~ 40 °C，酶解3~4 h，將溶液升溫至90~95°C，并于此溫度保持10~15 min，于10000 r/ min、4°C條件下離心15~20 min，取上清液，上清液采用I kDa超濾膜進行超濾處理，收集 分子量小于I kDa部分，置于截留分子量為100的透析袋中，三蒸水透析24 h，凍干，得酶解 物活性組分； 4) 赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的制備：將酶解物活性組分用三蒸水配成 0. 03~0. 05 mg/mL的溶液，將細胞膜固定相按照固液比I g: IOmL加入到活性組分溶液中， 35~40°C保溫孵育2~3 h后，4000 r/min離心10~15 min，留取上清液，沉淀用三蒸 水淋洗8~10次，合并洗滌液和上清液，凍干，即為細胞膜吸附剩余物；利用RP-HPLC建立 酶解物活性組分和細胞膜吸附剩余物的指紋圖譜，純化制備消失或峰面積顯著減小的差異 峰，并對其進行雞胚絨毛尿囊膜（CAM)血管生成抑制作用測定，活性最強峰經蛋白/多肽序 列分析儀測定氨基酸序列為Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)，ESI-MS檢測分子 量為 865. 98 Da。
[0008] 優選，所述1)中的腫瘤細胞為肝癌細胞Bel-7402 ; 優選，所述2)中大孔球形硅膠的預處理方法為：將大孔球形硅膠(規格：5 μm，200A) 中加入適量HCl溶液（I mol/L)，超聲處理15~20 min，轉移至圓底燒瓶瓶中攪拌回流水 解2~3 h后，將硅膠移至燒杯中，加雙蒸水洗滌3~5次，每次25~30 min。將洗滌處理 好的大孔球形硅膠減壓抽干，于120 °C下活化6~8 h。
[0009] 優選，所述4)中RP-HPLC條件為：進樣量為5~10 μ L ;色譜柱為Amethyst C18 (250 mm X 4.6 mm，5 μ m);洗脫條件為0~40 min內乙腈濃度由10%勾速升至50%;流 速0· 4 mL/min ;紫外檢測波長為215 nm。
[0010] 本發明為解決上述第三個技術問題所采取的技術方案為：一種赤魟軟骨多肽類血 管生成抑制因子的應用，其特征在于Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)對雞胚絨 毛尿囊膜（CAM)血管生成具有顯著抑制作用，Gly-Tyr-Ile-Cys-Pro-Gln-Trp (GYICPQW)具 有安全無毒副作用和活性強等優點，可用于制備抑制血管生成、防治腫瘤的藥物。
[0011] 與現有技術相比，本發明的優點在于：提取、純化工藝較先進、快速、準確度高，制 得的血管生成抑制因子活性顯著，可用于腫瘤疾病的治療。
[0012]
【附圖說明】
[0013] 圖1是本發明步驟示意圖； 圖2是本發明的酶解物活性組分（A)和細胞膜吸附剩余物（B)的RP-HPLC指紋圖譜。 [0014]
【具體實施方式】
[0015] 以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0016] 實施例：一種赤魟軟骨多肽類血管生成抑制因子的制備方法，制備流程如下：赤 魟軟骨一組織破碎一鹽酸胍抽提一超濾一細胞膜固定相吸附一HPLC指紋圖譜比較分析一 血管生成抑制因子。
[0017] 1)細胞膜懸液的制備：取血管內皮生長因子特異性受體（VEGFR)高表達的、處于 對數生長期的肝癌細胞Bel-7402,采用MEM培養基(含10%的胎牛血清)，于37°C、5 % CO2培養箱內培養，當細胞計數達到IO7時，應用胰蛋白酶將細胞消化下來，于4°C、1000 r/min 離心10 min，取沉淀用生理鹽水清洗2遍后，加入到50 mM的Tris-HCl溶液超聲30 min破 碎細胞。將懸液于1000 r/min、4°C條件下離心5 min，取上清液于12000 r/min、4°C條件 下離心25 min，得到細胞膜沉淀，用生理鹽水重懸，清洗3次后，加入生理鹽水至膜蛋白含 量為2. 2 mg/mL，即為細胞膜懸液； 2)細胞膜固定相的制備：取預處理的大孔球形硅膠加入到低溫（4°C)反應管中，在振 蕩條件下，按照固液比Ig :25 mL將細胞膜懸液加入到反應管中，吸附15 h，超聲研磨25 min后，于4000 r/min離心15 min，收集沉淀，用生理鹽水洗滌3次，除去未結合的細胞膜， 得Bel-7402細胞膜固定相。
[0018] 3)赤魟軟骨蛋白的制備與酶解：將破碎勻漿的赤魟軟骨按固液比I g : 15 mL加 入到1.0 mol/L鹽酸胍溶液中，4 °C、振蕩抽提48 h后，于4 °C、10000 r/min離心15 min， 取上清液裝入截留分子量為I kDa的透析袋中，用雙蒸水于4 °C以下透析24 h，透析液冷 凍干燥，得赤魟軟骨蛋白；將赤魟軟骨蛋白按固液比I