一種銅藻多糖酶解物及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及海藻多糖提取物技術領域，具體涉及一種銅藻多糖酶解物及其在制備 調節腸道菌群失調的食品或藥物中的應用。 (二）
【背景技術】
[0002] 腸道健康是近年來備受矚目的諸多健康問題之一，由于環境污染、抗生素在食物 鏈中的沉積、居民膳食結構的變化以及人們健康需求的提高，對健康關注度的持續增長，人 們對健康的理解已經開始由"表"及"里"，更加關注健康的本源一體內微生態環境。益生元 在增加腸道內源性益生菌的數量、調節腸道菌群組成等方面有著很大優勢。多糖作為代表 性的益生元，具有來源廣泛、性質穩定、代謝產物無毒無害等優點，是一種天然的功能性食 品成分。
[0003] 海藻是海洋生物資源的重要組成部分。銅藻又稱柱囊馬尾藻、草茜、竹茜菜，隸屬 于馬尾藻屬，是北太平洋西部特有的暖溫帶性海藻，不連續分布在我國沿海，是提取褐藻膠 的重要原料。銅藻多糖具有增強機體免疫力、抗菌、抗病毒和抑制腫瘤細胞等生理活性，但 目前主要應用于飼料和有機肥料方面，產品附加值低，造成資源的嚴重浪費。目前，關于海 藻多糖研宄主要集中于羊棲菜、巖藻、海帶多糖等分離純化、藥理活性等方面。
[0004] 目前市場上常見的具有改善胃腸道功能的保健食品或藥品很多。中國專利公開號 CN102172270A，公開了一種調理保健胃腸的多糖沖劑及其制備方法，由猴頭菇多糖粉、山楂 粉、菊粉、低聚果糖粉、低聚木糖粉復合配比而成。利用微生物發酵技術獲得猴頭菇多糖比 分離純化提取猴頭菇多糖效率高，更經濟，但是其純度和調理效果較后者差。中國專利公開 號CN102018216A，公開了一種調節腸道菌群和增強免疫力的含雙歧桿菌的組合物，所述組 合物由經高密度培養和雙層包埋的雙歧桿菌、低聚糖、維生素、金屬元素和輔料混合配制而 成。雖然雙歧桿菌經過雙層包埋技術和高密度培養，生產速率提高，較一般包埋技術到達腸 道后外層膠體更易溶解，但生產成本高，工藝繁瑣。
[0005] 銅藻俗稱"丁香屋"（中國南麂島），隸屬于馬尾藻屬。銅藻是北太平洋西部特有的 暖溫帶性海藻，是提取褐藻膠的重要原料，因富含有益的生源要素而被廣泛應用到醫藥、食 品、飼料和有機肥料方面。研宄表明，銅藻藻體含褐藻酸、褐藻淀粉、甘露醇及多種氨基酸、 多糖、蛋白質、維生素等。銅藻具有消痰軟堅、清熱利水的功效。近年來，銅藻多糖的開發和 用途已經成為一個研宄的新課題，但目前對于銅藻多糖的研宄主要集中在其保濕保潤作用 以及抗氧化活性，例如本申請發明人之前發表的文章[徑向流耦合超濾分離純化銅藻多糖 及其煙絲保潤的應用，食品與發酵工業，2012年08期，第197-202頁]、[銅藻多糖微波 輔提工藝優化及其抗氧化活性研宄，核農學報，，2014年06期，第1062-1069頁]以及專利 申請CN2015100921966均是關于銅藻多糖的抗氧化活性或者保濕保潤性能，我們的實驗表 明，根據這些文獻制備得到的銅藻多糖或者銅藻多糖的酶修飾物對于胃腸道功能的改善不 起作用。 (三）
【發明內容】
[0006] 本發明的目的是提供一種銅藻多糖酶解物及其在制備調節腸道菌群失調的食品 或藥物中的應用，所述的銅藻多糖酶解物通過控制其分子量和雜質含量，使得對于有益菌 具有顯著的增值作用，降低腸道PH，從而能夠改變腸道菌群結構。
[0007] 為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：
[0008] 一種銅藻多糖酶解物，其通過如下方法制備：
[0009] (1)酶解預處理：取銅藻粉末與水混合，調節PH為5. 5,加入復合酶，所述復合酶為 木瓜蛋白酶與纖維素酶按照質量比1 :1的混合，然后于50°c攪拌60~80min，離心取上清 液，即得酶解預處理液；
[0010] (2)醇沉：取酶解預處理液，加入乙醇溶液使得最終乙醇體積分數為60%并在該 條件下進行沉淀操作，冷凍離心得到沉淀，加入蒸餾水使沉淀溶解，再經蒸發溶劑、冷凍干 燥得到銅藻粗多糖SHP組分；
[0011] (3)徑向流脫色脫蛋白：使用裝填有弱堿性陽離子交換樹脂的徑向流色譜柱對銅 藻粗多糖SHP組分進行脫色脫蛋白操作，其中洗脫劑為純水，得到SHPA多糖；
[0012] (4) SHPA酶解及純化：在pH 4. 5~5. 5的HAc-NaAc緩沖液體系中，SHPA多糖和葡 聚糖酶于50°C進行酶解反應2~3h，終止反應后酶解反應液采用孔徑大小為500Da規格的 透析袋進行流水透析，透析液經濃縮、冷凍干燥得到酶解產物；
[0013] (5)離子柱層析：酶解產物配成水溶液用0.45μπι微濾膜過濾，所得濾液用 DEAE-Sepharose Fast Flow離子柱層析系統進行離子柱層析，分別以蒸餾水、0.1~ 0. 4mol/L NaCl水溶液進行洗脫，選定最大洗脫峰對應的洗脫液，濃縮、用0. 45 μ m微濾膜 過濾得到濾液；
[0014] (6)凝膠柱層析：步驟（5)所得濾液用Sephadex G-25凝膠層析系統進行凝膠柱 層析，以蒸餾水進行洗脫，以硝酸銀指示劑檢測洗脫液中是否脫鹽完全并收集不含鹽的多 糖部分，濃縮，冷凍干燥得到銅藻多糖酶解物。
[0015] 進一步，步驟（1)中，銅藻粉末、水、復合酶的投料質量比為I :14. 5~15. 5 : 0· 4%~0· 6%，優選為 1:15:0. 5%。
[0016] 進一步，步驟（3)中，所述弱堿性陰離子交換樹脂為A103S、A105或A100,優選 A103S。所述的徑向流脫色脫蛋白可按照文獻（例如[銅藻多糖微波輔提工藝優化及其抗 氧化活性研宄，核農學報，2014年06期，第1062-1069頁])報道的方法進行操作，得到洗脫 液，洗脫液經濃縮、冷凍干燥即得到SHPA多糖。
[0017] 進一步，步驟（4)中，SHPA多糖與葡聚糖酶的投料質量比為I :0.5~2,優選為 1:1~2,更優選1:1 ;所述葡聚糖酶在所述緩沖液體系中的質量濃度為0. 3-0. 4%。
[0018] 進一步，步驟⑷中，酶解時間優選為3小時。
[0019] 進一步，步驟（5)中，離子柱層析中，上樣流速優選為1~2mL/min，洗脫流速優選 為 2 ~4mL/min〇
[0020] 進一步，步驟（6)中，凝膠柱層析中，上樣流速為1~3mL/min，洗脫流速為2~ 4mL/min〇
[0021] 本發明中，冷凍離心在轉速8000~lOOOOrpm、溫度4~15°C條件下進行，離心時 間優選5~15min〇
[0022] 本發明中，木瓜蛋白酶、纖維素酶、葡聚糖酶均使用市售商品。
[0023] 本發明還提供了所述銅藻多糖酶解物在制備調節腸道菌群失調的食品或藥物中 的應用。
[0024] 本發明的有益效果在于：
[0025] (1)本發明采用復合酶解法提取銅藻多糖，一方面通過降解細胞壁使多糖更易提 取從而提高得率；另一方面可以針對其中的大多數雜質（纖維素、蛋白質等）選擇性降解， 以更利于后續分離純化的進行；同傳統水提法、微波和單一酶解法等相比，能夠提高多糖得 率，有效控制雜質含量，同時提取工藝條件溫和，節能降耗。
[0026] (2)本發明制得的銅藻多糖酶解物對于有益菌具有顯著的增值作用，證明其能夠 改變腸道菌群結構，降低腸道PH，可用于制備調節胃腸道菌群失調的食品或藥物。 (四）
【附圖說明】
[0027] 圖1是發酵過程pH的變化；
[0028] 圖2是益生元指數變化。 (五）
【具體實施方式】
[0029] 下面以具體實施例對本發明的技術方案做進一步說明，但本發明的保護范圍不限 于此：
[0030] 實施例1
[0031] (1)酶解預處理：
[0032] 將銅藻洗凈，控水，置于烘箱內60°C烘干，粉碎。揀選破碎后過100目篩網的銅藻， 取100.0 g粉末，加入1500g的水中，調節pH為5. 5,加入0. 5g復合酶，復合酶為木瓜蛋白酶 (上海藍季科技發展有限公司，100萬U/g)與纖維素酶（張家港金源生物化工有限公司，8 萬u/g)質量比1 :1的混合，放置于50°C恒溫水浴鍋，進行勾速攪拌60min，4000rpm離心10 分鐘，取上清液即得酶解預處理液；
[0033] ⑵醇沉：
[0034] 取酶解預處理液旋轉蒸發濃縮至1L，加入95%乙醇溶液至最終乙醇體積分數為 60 %，靜置過夜。樣液冷凍離心10min (轉速lOOOOrpm，溫度4°C )，取沉淀，加入少量蒸餾水 將沉淀完全溶解，減壓蒸發并將殘留酒精完全蒸發，經冷凍干燥得銅藻粗多糖SHP組分，酶 解提取法的多糖得率達2. 52%。
[0035] (3)徑向流脫色脫蛋白工藝
[0036] 將步驟（2)得到的粗多糖加水配制得到7mg/ml濃度的銅藻粗提液，加入裝填 有A103S陰離子樹脂的徑向流色譜柱（所用徑向流色譜柱為美國S印ragen公司的型號 SUPERFL0-250 COLUMN的徑向流色譜柱）中，用純水洗脫，徑向流色譜的條件為：上樣流速/ 柱高為3ml/(min · cm)，洗脫速度/柱高為12ml/(min · cm)，柱體積/上樣量為5mL/mL，洗 脫30min，收集得到洗脫液，旋轉蒸發將上清液濃縮，經冷凍干燥得SHPA多糖樣品。蛋白脫 除率達到89. 3 %，SHPA多糖含量為79. 6 %。
[0037] (4) SHPA酶解及純化：
[0038] 取0. 4g SHPA溶于IOOmL乙酸-乙酸鈉緩沖液（pH 5. 0)配制成4mg/mL樣液，取 葡聚糖酶加入緩沖液（pH 5.0)配制成質量濃度4%酶溶液。將樣液IOmU酶液ImL各自保 溫lOmin，混勾，于50°C反應2h，沸水浴加熱5min鈍化酶活性終止反應。靜置冷卻，減壓蒸 發濃縮至4 %待用。
[0039] 選取孔徑大小為500Da規格的透析袋，裝入可溶性固形物4%的15mL酶解反應液 分別流水透析24h，靜置過夜。重復多次，并將透析液減壓濃縮至10mL，冷凍干燥，儲備待 用。
[0040] 將酶解產物組分配制成10~20mg/mL的水溶液，過孔徑為0. 45 μ m微孔濾膜 (φ50 mm >，所得濾液進行離子柱上樣。
[0041] (5)離子柱層析：DEAE-Sepharose Fast Flow 離子柱 CKK 26 X IOOcm)層析系統， 上樣量15mL，上樣流速為2mL/min ;分別以蒸餾水、0. lmol/L NaCl水溶液進行洗脫，洗脫流 速為3. 5mL/min，自動分部收集器收集洗脫液，每管8mL。繪制洗脫曲線，并分別收集各洗脫 峰所對應的組分。
[0042] 選定最大洗脫峰對應洗脫液濃縮至5mg/mL左右濃度，用孔徑為0. 45 μ m微孔濾膜(φ5〇 mm)過濾，待凝膠柱層析。
[0043] (6)凝膠柱層