一種用于霍亂弧菌實時熒光定量pcr檢測的多核苷酸、方法和試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種生物工程技術領域的質粒分子，具體涉及一種適用于霍亂弧菌實 時熒光定量PCR檢測的質粒標準分子及其構建方法、定量方法和應用。
【背景技術】
[0002] 霍亂弧菌（Vibrio cholerae)是能引起一類以腹瀉為主要癥狀的烈性傳染病的一 種致病菌，霍亂弧菌的快速準確鑒定，對該病的預防和治療有著重要作用。長期以來人們發 現，01群霍亂弧菌能夠引起霍亂的流行。0139群霍亂作為新發傳染病，1992年在印度和孟 加拉國引起霍亂大流行。1993年以來在我國許多地區也不同程度出現0139群霍亂弧菌引 起的疫情，近幾年來，0139群霍亂暴發的比例仍然在不斷上升。01群和0139群霍亂弧菌的 致病性取決于其菌株與毒素相關的編碼產物，如霍亂弧菌毒素共調菌毛（TCP)，毒素表達調 控蛋白（toxR)等。霍亂的檢測方法包括生化培養、血清學試驗及噬菌體分型等，這些方法 存在著檢出率偏低，檢查時間長的缺點，往往達不到疫情控制的需要。熒光定量PCR方法則 可以快速、靈敏地根據霍亂弧菌的特異基因序列的檢出情況，在幾小時內即可完成菌株的 檢出。質粒DNA標準物質是一種含有檢測目的基因的特異性片段的重組質粒分子，在PCR定 性檢測中可以作為陽性對照，在PCR定量分析中可以作為定量分析的標準品，構建定量分 析的標準曲線。目前質粒DNA分子作為基因檢測的標準物質得到了越來越多的深入研究和 應用，但是針對霍亂弧菌實時熒光PCR檢測方法的質粒DNA標準物質還是空白。在實際霍 亂弧菌實時熒光PCR時，各單位使用的多是自行設計構建的質粒DNA分子作為標準品，其中 的目的基因特異性片段各不相同，同時缺乏統一的定值方法，質粒DNA分子定值準確度差， 造成各實驗室之間的檢測結果差異極大，缺乏可比性。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種用于霍亂弧菌實時熒光定量PCR檢測的多核苷酸、方 法和試劑盒。
[0004] 本發明的第一方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含霍亂弧菌毒 力調控子toxR的基因序列。
[0005] 在另一優選例中，所述霍亂弧菌毒力調控子toxR的基因序列選自下組：
[0006] (a)序列如SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列；
[0007] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO. : 1所示序列的同源性彡95% (較佳地彡98% )的 多核苷酸序列；
[0008] (c)序列與SEQ ID NO. :1所示多核苷酸完全匹配或完全互補并且長度為 100bp-654bp(較佳地150-645bp，更佳地200-500bp)的多核苷酸序列；
[0009] (d)與（a)-(c)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0010] 在另一優選例中，所述所述多核苷酸的序列選自下組：
[0011] (a)序列如SEQ ID NO. :2或SEQ ID NO. : 1所示的多核苷酸序列；
[0012] (b)核苷酸序列與SEQ ID NO. :2或SEQ ID NO. :1所示序列的同源性彡95% (較 佳地彡98% )的多核苷酸序列；
[0013] (C)與（a)-(b)任一所述的多核苷酸序列互補的多核苷酸序列。
[0014] 本發明的第二方面，提供了一種分離的DNA構建物，所述DNA構建物中包含本發 明的第一方面所述的多核苷酸，以及任選的標簽序列、酶切序列、啟動子序列和/或載體序 列。在本發明的一個優選地實施方式中，在本發明第一方面所述的多核苷酸兩端設有線性 酶切位點。
[0015] 在另一優選例中，所述DNA構建物為線性DNA構建物或環狀DNA構建物。
[0016] 在另一優選例中，所述DNA構建物為質粒或表達載體。
[0017] 在另一優選例中，所述的質粒或表達載體作為霍亂弧菌檢測的標準分子（質粒標 準分子）。
[0018] 在另一優選例中，所述DNA構建物為質粒或表達載體，并且所述質粒或表達載體 的骨架質粒選自下組：pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScriptIISK和pGEM。
[0019] 在另一優選例中，所述質粒的序列如SEQ ID NO :2所示。
[0020] 本發明的第三方面，提供了一種試劑盒，所述試劑盒中包括本發明第一方面所述 的多核苷酸或者本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0021] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括選自下組的引物序列：
[0022] (I)SEQ ID NO. :3 和 SEQ ID NO. :4 所示的引物序列；
[0023] (2) SEQ ID NO. :5 和 SEQ ID NO. :6 所示的引物序列；
[0024] (3) SEQ ID NO. :7 和 SEQ ID NO. :8 所示的引物序列；和
[0025] (4) SEQ ID NO. :9 和 SEQ ID NO. : 10 所示的引物序列。
[0026] 在另一優選例中，所述試劑盒中還包括SEQ ID NO. : 11所示的探針序列。
[0027] 本發明的第四方面，提供了如本發明第一方面所述的多核苷酸、本發明第二方面 所述的DNA構建物或本發明第三方面所述的試劑盒的用途，用于霍亂弧菌的檢測。
[0028] 在另一優選例中，所述檢測為非診斷或治療目的。
[0029] 在另一優選例中，所述檢測為熒光定量PCR檢測。
[0030] 本發明的第五方面，提供了 一種霍亂弧菌實時熒光定量PCR檢測方法，所采用的 標準物質是本發明第一方面所述的多核苷酸或本發明第二方面所述的DNA構建物。
[0031] 在另一優選例中，所述方法中采用的引物對選自下組：
[0032] (I)SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO. :4所示的序列構成的引物對；
[0033] (2) SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列構成的引物對；和
[0034] (3) SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8所示的序列構成的引物對。
[0035] 在另一優選例中，所述方法中使用的探針序列如SEQ ID NO. : 11所示。
[0036] 本發明的第六方面，提供了一種多核苷酸產品，所述產品包括：
[0037] (i)霍亂弧菌標準品，所述的標準品選自：本發明第一方面所述的多核苷酸和本 發明第二方面所述的DNA構建物；
[0038] (ii)特異性擴增霍亂弧菌序列的引物對，所述引物對選自下組：
[0039] (I)SEQ ID NO. :3和SEQ ID NO. :4所示的序列構成的引物對；
[0040] (2) SEQ ID NO. :5和SEQ ID NO. :6所示的序列構成的引物對；和
[0041] (3) SEQ ID NO. :7和SEQ ID NO. :8所示的序列構成的引物對。
[0042] 在另一優選例中，所述的產品為多核苷酸的組合（combination)，較佳地所述組分 ⑴和（ii)是各自獨立的。
[0043] 在另一優選例中，所述的廣品為試劑盒形式。
[0044] 在另一優選例中，所述的產品中還包括SEQ ID NO. : 11所示的探針序列。
[0045] 本發明的第七方面，提供了一種霍亂弧菌的質粒標準分子的制備方法，其特征在 于，包括以下步驟：
[0046] ①人工合成霍亂弧菌的毒力調控子toxR基因序列，所述毒力調控子toxR表達基 因序列如序列表中SEQ ID NO :1所不；
[0047] ②將步驟①所得霍亂弧菌的毒力調控子toxR表達基因序列克隆至克隆載體上， 得到霍亂弧菌的質粒標準分子。
[0048] 在另一優選例中，所述步驟②中所述克隆載體為質粒pUC19, pUC18, pUC118， pUC119，pBlueScript II SK或pGEM;優選地，步驟②所述克隆載體為pUC19。
[0049] 應理解，在本發明范圍內中，本發明的上述各技術特征和在下文（如實施例）中具 體描述的各技術特征之間都可以互相組合，從而構成新的或優選的技術方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說明】
[0050] 圖1是本發明質粒標準分子PLW07的圖譜。
[0051] 圖2是本發明所得質粒標準分子PLW07穩定性檢測結果圖。
[0052] 圖3是利用本發明質粒標準分子建立的實時熒光PCR標準曲線。
【具體實施方式】
[0053] 本發明人通過廣泛而深入的研究，獲得一段能夠用于霍亂弧菌PCR檢測的多核苷 酸序列以及與之相配合的引物對，實驗結果表明，采用合適的骨架質粒將所述多核苷酸序 列制備為標準質粒分子，并配合本發明的引物對進行實時熒光PCR檢測，具有極佳的特異 性和靈敏度，并且穩定性良好。
[0054] 本發明所要解決的技術問題是為了克服現有的霍亂弧菌實時熒光PCR檢測方法 中缺乏陽性標準品和陽性標準品配置的問題，提供了一種適用于霍亂弧菌實時熒光PCR檢 測的質粒標準分子以及該質粒標準分子的構建方法、定量方法和應用。
[0055] 實時熒光PCR檢測霍亂弧菌的原理
[0056] 采用實時熒光PCR技術