利用SPR基因dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖的方法，屬昆 蟲生理和植物害蟲防治技術領域。
【背景技術】
[0002] 斜紋夜蛾 (Fabricius) (Lepidoptera :Noctuidae)，是我國 糧、棉、煙草、蔬菜等作物的重要害蟲，且具有很強的耐藥性。對于該種的防治目前主要還是 采用化學防治，由于該蟲的適應性及耐藥性極強，在防治該蟲時化學農藥用量越來越高，給 食品安全及環境污染問題帶來嚴峻考驗。探索綠色防治該害蟲的新技術新手段已成為當前 必須重視的問題。
[0003] 近年來興起的RNA干擾（RNAi)技術除了在基因功能研宄上取得了驕人的成績， 同時也在病蟲害防治上顯示出了巨大的潛力。選擇合適的靶基因和適當的導入方法是RNAi 技術成功應用于害蟲防治的關鍵。與害蟲生存(如生長發育）與生殖(如交配產卵）等有關 的關鍵基因是RNAi的理想靶基因。基于注射dsRNA的RNAi技術常用于基因功能研宄，在 害蟲防治研宄和實踐中，害蟲通過取食dsRNA (人為噴施、菌體或轉基因植物產生）是較為 可行的導入手段，其關鍵點是要明確害蟲是否可通過取食dsRNA而導致靶基因沉默并影響 其生存和生殖。
[0004] Yapici等（2008)最先從果幡Λ 獲得一個性肽受體（sex peptide receptor, SPR)，交配過的SPR基因缺失的雌幡與野生處女雌幡一樣只產少量卵 且容易對雄性求愛產生應答，而交配過的野生雌蠅卻不容易接受雄性的求愛及產卵數量開 始成倍增加。隨后SPR基因也在棉鈴蟲/fe/icoFerjDa arffiigera (Hanin et al. 2012)及 斜紋夜蛾5： /itora (Li et al. 2014)中被發現，注射RNAi表明該基因在這兩種蛾類中 同樣調控雌性的生殖，并可能影響性信息素的合成與釋放。另有研宄還發現，SPR也可能是 幼蟲蛻皮和生長發育調節的重要基因 （Yamanaka et al. 2010)，因此，如果在幼蟲中沉默 SPR基因，有可能導致其生長發育受到抑制，進而死亡。上述這些研宄中SPR的RNAi只在 成蟲中做過，沒有在幼蟲中開展過，采用的是體內表達和注射dsRNA法，并沒有采用過取食 dsRNA法。因此，本發明通過斜紋夜蛾幼蟲和成蟲取食SPR基因的dsRNA，導致SPR基因表 達沉默，從而致使斜紋夜蛾幼蟲生長發育受到抑制，進而死亡，也能夠導致雌性成蟲交配后 不產卵或只產少量卵。經文獻檢索，未見與本發明相同的公開報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術之不足，而提供一種利用SPR基因 dsRNA抑制斜 紋夜蛾生長發育和生殖的方法。
[0006] 本發明通過斜紋夜蛾幼蟲和成蟲取食SPR基因的dsRNA，導致SPR基因表達沉默， 從而致使斜紋夜蛾幼蟲生長發育受到抑制，進而死亡，也能夠導致雌性成蟲交配后不產卵 或只產少量卵。進而抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖，也為綠色防治該害蟲提供新思路和技 術。
[0007] 本發明的利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖的方法，其具體步驟 如下： (1 )、SPR基因 RNAi目標片段選擇及dsRNA制備 根據NCBI數據庫中登陸號為JX070670的斜紋夜蛾SPR基因的cDNA序列，通過 siDirect version 2. 0軟件進行分析，找到一段最優RNAi目標片段，即JX070670的cDNA 序列的1564 -1792堿基，長229bp，具體序列為： 5' -TAATTTCAAGCACTATAGTCGAAATTTTAGATTACTATATAGCAAACATTTTGATTCTTATAACCAAT TTCTTTATCTTGGTCTCTTATCCTATTAATTTTGCTATTTACTGTGGTATGTCGAGGCAGTTTAGGGAGACGTTTA AAGAACTGTTCATTCGAGGAGCTGTTACTAGCCGTAAGAATGGCGGCTCTAGTAGATACTCCCTGGTCAACGGTCCA AGGACATG-3' 再根據這段長229bp的序列設計dsRNA制備引物一對:ιΗ向引物5' -TAATACGACTCACTA TAGGGCATAATTTCAAGCACTATAGTC-3 '反向引物 5 ' -TAATACGACTCACTATAGGGCATGTCCTTGGACCG TTGAC-3'，其中下劃線部分序列為T7啟動子； 用這段引物，以斜紋夜蛾總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，通過PCR獲得目標基因片 段，再以這一片段為模板采用試劑盒合成dsRNA ; (2)、用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖 a，斜紋夜蛾的人工飼養 斜紋夜蛾幼蟲采用人工飼料在24~27°C，60~80%RH，光照：黑暗=14:10的條件下 飼養；在蛹期將雌雄分開單獨關養，羽化的成蟲用10%蔗糖水喂養；在上述條件下幼蟲期為 15天，蛹期11天，成蟲期12天；人工飼料為：玉米粉100g，黃豆粉100g，胡蘿卜粉50g，酵 母粉3(^，干酪素2(^，蔗糖2(^，瓊脂粉2(^，水100〇1111，100°0蒸111; b. dsRNA 喂食 將dsRNA拌入人工飼料中，從0日齡幼蟲開始，每天喂食一次，即：0-2日齡每天每只喂 O.lyg dsRNA, 3-6日齡每天每只喂0.5yg dsRNA, 7-15日齡每天每只喂2yg dsRNA;給 0-3日齡的成蟲每天每只喂食約2 yg dsRNA，即將dsRNA加入到10%蔗糖水中以供取食； 以喂食不添加 dsRNA的飼料和糖水的幼蟲和成蟲為對照，通過各期生長發育、致死率、及產 卵分析抑制生長發育和生殖。
[0008] c. dsRNA喂食抑制生長發育和生殖分析 通過各期生長發育、致死率、及產卵分析，結果表明喂食dsRNA的幼蟲生長緩慢，幼蟲 期達20天以上，幼蟲期死亡率在40%以上，蛹期在15天以上，羽化率不足50%，雌蟲交配后 產卵量只有400個。而喂食不添加 dsRNA的飼料和糖水的斜紋夜蛾，幼蟲期約為15天，幼 蟲期死亡率在10%以下，蛹期11天，羽化率在80%以上，成蟲期12天，交配后雌蟲產卵量平 均在1000個以上。
[0009] 本發明通過人工合成上述dsRNA進行田間噴施，或通過轉基因技術將該目標片段 的dsRNA表達載體轉化到菌體或植物中產生相應的dsRNA，斜紋夜蛾通過感染菌體或取食 植物組織或花蜜，間接獲得SPR基因的dsRNA，引起SPR基因表達沉默，進而抑制斜紋夜蛾 生長發育和生殖，從而達到防治該害蟲的目的。
[0010] 本發明的有益效果在于：利用取食SPR基因 dsRNA的基因沉默技術來防治農業重 要害蟲斜紋夜蛾，能夠顯著抑制斜紋夜蛾的生長發育和生殖，為綠色防治該害蟲提供了一 個新的思路和技術。
[0011]
【具體實施方式】： 本實施例的利用SPR基因 dsRNA抑制斜紋夜蛾生長發育和生殖的方法同
【發明內容】
部分 所述。
[0012] 下面通過實施例對本發明作詳細的描述，具體步驟如下： (一) 、人工飼料配制所用原料來源：
(二) 、飼料配制 取玉米粉100g，黃豆粉100g，胡蘿卜粉50g，酵母粉30g，干酪素20g，蔗糖20g，瓊脂 粉20g，水1000ml，混勻，置于蒸鍋內蒸lh。