一組核苷酸序列及在嗜水氣單胞菌鑒定中的應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種DNA恒溫擴增技術，尤其涉及一種嗜水氣單胞菌的鑒定方法，屬 于微生物快速鑒定領域。
【背景技術】
[0002] 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)是一種革蘭陰性、能運動、兼性厭氧、氧化 酶陽性的桿狀細菌，屬于弧菌科、氣單胞菌屬。嗜水氣單胞菌廣泛分布于自然界的各種水 體，是多種水生動物的原發性致病菌，是典型的人-獸-魚共患病的病原菌。近年來大量研 宄表明，嗜水氣單胞菌可單獨或者與其他致病菌共同感染，引起人類腸胃炎、敗血癥以及外 傷引起軟組織感染等病癥，危害食品安全，并且是免疫缺陷病人和肝功能疾病患者的條件 致病菌，具有重要的公共衛生意義。因此，為了給予臨床病人準確快速的治療和嗜水氣單胞 菌的流行病學調查，研發一個省時、省力和特異性較高的嗜水氣單胞菌檢測方法成為必要。
[0003] 雖然嗜水氣單胞菌誘發腸胃炎的致病機理并未完全闡明，但研宄者已經對一些潛 在的毒力因子進行了深入的研宄。攝取鐵離子與一些病原菌的毒力密切相關，人體中的亞 鐵血紅素是病原菌鐵離子的一個重要來源，并且許多病原菌本身就具有亞鐵血紅素運輸系 統，desA基因是編碼嗜水氣單胞菌亞鐵血紅素鐵離子利用系統的重要基因之一，并且編碼 一種外膜蛋白受體，可以從環境中攝取細菌生長和存活所必需的鐵離子，因此是一個理想 的檢測目的基因。
[0004] 目前對于嗜水氣單胞菌分離鑒定主要依賴于傳統的增菌培養和生化鑒定，該方法 耗時大約5天，包括增菌、選擇培養及后續的生化鑒定，耗時耗力。生化結果的判讀依賴于 人的主觀判斷，導致結果重復差，易錯判。隨著核酸診斷技術的快速發展，一些以PCR為基 礎的診斷技術（如普通PCR技術，熒光PCR技術）被用于嗜水氣單胞菌的快速診斷，然而這 些方法依賴于昂貴的儀器設備，需要后續的電泳操作，較高的探針合成費用，以及熟練的操 作人員。一些基層實驗室無法開展，限制了這些技術的運用。此外PCR檢測技術的靈敏度 差，檢測過程耗時較長，不利于快速檢測和應急檢測。隨著恒溫技術的出現，環介導恒溫擴 增技術（LAMP)已經被用于很多病原菌的檢測，然而該技術的引物設計復雜，對目的基因的 序列長度要求較長且保守性要求較高。因而，急需發展一種簡單、快速、靈敏和特異的診斷 技術用于嗜水氣單胞菌檢測。
[0005] 交叉恒溫擴增技術（Cross priming amplification，CPA)是由 Xu Gaolian 等建 立的一種新的恒溫核酸擴增技術，具有靈敏高、操作簡單、不依賴于昂貴設備、產物易檢測 等優點。該技術已被廣泛用于分子診斷領域。CPA先在靶序列上設定5個任意序列4a、la、 3s、2s和5s，設計與之互補的5條引物，5條引物之中交叉引物為1條，即As，該交叉引物自 5'末端依次含有2a和Is片段，即5' -2a-ls ;置換引物為2條，即4s和5a ;擴增引物為2 條，即3a和2a。利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶在恒溫條件下催化新鏈合成，靶序 列能夠得以高效擴增。
[0006] CPA反應僅需恒溫在62~66°C之間的一個溫度即可，該溫度是雙鏈DNA復性及延 伸的中間溫度，雙鏈DNA在該溫度范圍內處于半解離和半結合的動態平衡狀態中，任何一 個引物向雙鏈DNA的互補部位進行堿基配對延伸時，另一條鏈就會解離，變成單鏈。CPA在 鏈置換Bst DNA聚合酶的作用下，以As引物Is區段的Y末端為起點，與對應的模板DNA 序列互補配對，啟動鏈置換DNA合成。4s引物與模板片段4a互補結合，以3'末端為起點， 通過鏈置換活性DNA聚合酶的作用，首先置換出As引物合成的DNA鏈，同時合成自身DNA。 最終4s引物合成而得的DNA鏈與模板DNA形成雙鏈。然而由As引物先合成的DNA鏈被4s 引物進行鏈置換產生一單鏈，該單鏈通過模板5'末端的3s區段和引物3a互補，啟動DNA 合成；模板2s區段和引物2a互補，啟動鏈置換DNA合成，釋放含引物3a的DNA合成鏈，該合 成鏈能夠與引物2a和As互補結合，啟動第一個循環擴增。此外由引物2a互補合成的新鏈 能被下游的置換引物5a置換，產生的新鏈發生自我堿基配對，形成單一莖環狀結構，啟動 第二個循環擴增。CPA反應擴增的第一個循環階段：形成的短鏈產物處于解鏈與結合動態 平衡，引物能夠與解離的單鏈結合實現擴增循環；第二個循環階段：在啞鈴狀結構中，As引 物中的Is與環上單鏈Ia雜交，啟動新一輪鏈置換反應，擴增出短鏈DNA，形成的短鏈產物同 樣處于解鏈與結合動態平衡，引物能夠與解離的單鏈結合實現擴增，并產生新的莖環結構， 從而實現CPA的循環擴增。CPA反應可以特異、高效、快速的擴增目的DNA，在1小時之內使 產物的量達到IO9個拷貝。
[0007] CPA擴增之后，其產物的檢測可以通過瓊脂糖電泳后染色觀察。較為簡便的方法是 直接在反應體系中加入Loopamp熒光染料，呈現綠色為陽性反應，橙紅色為陰性反應。也可 以通過擴增副產物焦磷酸鎂沉淀的濁度進行判斷，液體渾濁，離心或有白色沉淀的為陽性 反應，無此現象的則為陰性反應。
[0008] 本發明的目的就是通過特異的引物設計，建立一種用于非診斷目的的嗜水氣單胞 菌的方便、快速、特異、靈敏的CPA檢測方法，以能夠在基層實驗室進行大規模的推廣使用。
【發明內容】
[0009] 基于上述目的，本發明首先提供了一組用于交叉恒溫擴增技術的核苷酸序列，所 述序列包括：含有如SEQ ID NO :6所示序列的核苷酸序列作為交叉引物，含有如SEQ ID NO: 3所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :4所示序列的核苷酸序列作為擴增引物，含 有如SEQ ID NO: 1所示序列的核苷酸序列和含有如SEQ ID NO :5所示序列的核苷酸序列作 為置換引物。
[0010] SEQ ID N0:l、3、4、5和6是根據嗜水氣單胞菌desA基因作為模板基因設計出來 的。本發明的發明點在于上述5種序列能夠與嗜水氣單胞菌desA基因的特定區段進行特 異性的結合。含有上述針對desA基因具有特異性的5種序列的引物，例如對SEQ ID NO: 1、3、4、5和6的5'端和/或3'端的添加性修飾都能夠實現本發明的目的，因此也都在本 發明的保護范圍之內。
[0011] 在一個優選的實施方案中，所述序列包括：如SEQ ID N0:6所示的核苷酸序列作為 交叉引物，如SEQ ID NO :3所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :4所示的核苷酸序列作為擴 增引物，如SEQ ID NO :1所示的核苷酸序列和如SEQ ID NO :5所示的核苷酸序列作為置換 引物。
[0012] 其次，本發明還提供了應用上述序列組合進行交叉恒溫擴增的方法，所述方法包 括如下步驟：
[0013] (1)將待檢測樣本、上述的5種序列作為引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、MgSO4、甜菜 堿以及交叉恒溫擴增緩沖液加入到反應容器中；
[0014] (2)將步驟⑴所得的混合液放置于62~66°C之間的溫度環境中進行DNA擴增 反應；
[0015] (3)檢測步驟⑵獲得的產物。
[0016] 優選地，步驟（1)中所述待檢測樣本為DNA提取物，待檢測樣本的來源可以為細菌 培養物、體液或人體分泌物樣本。
[0017] 優選地，在步驟（1)的反應容器中的所述置換引物的濃度為0.3mM，所述交叉引物 的濃度為2. 4mM，所述擴增引物的濃度為I. 44mM。
[0018] 優選地，步驟（2)中所述的溫度環境為65°C。
[0019] 優選地，步驟⑵中所述的DNA擴增反應時間為1小時，本領域技術人員可以根據 實際檢測進度的需要對反應時間進行適當地調整，而不會影響實際的反應效率。
[0020] 優選地，步驟（3)所述的檢測方法為電泳檢測法、濁度檢測法、或染色檢測法。
[0021] 電泳檢測法：擴增產物是一系列不同大小的DNA片段混合物，陽性產物為電泳后 在凝膠上顯現不同大小區帶組成的階梯式圖譜，而陰性反應不出現條帶。
[0022] 濁度檢測法：CPA在合成DNA的同時還產生大量的焦磷酸根離子，它們能與鎂離子 結合生成白色的焦磷酸鎂沉淀，可根據反應體系中是否形成白色沉淀來定性判斷CPA反應 是否發生。
[0023] 染色檢測法：在反應體系中加入的Loopamp焚光染料是一種媽黃綠素螯合劑，在 反應起始，體系中的錳離子將鈣黃綠素螯合，不發射熒光；反應結束后生成Mn2P2O7，釋放出 鈣黃綠素而發射熒光。呈現綠色為陽性反應，橙紅色為陰性反應。
[0024] 更為優選地，所述染色檢測使用的染料為Loopamp熒光染料FD。
[0025] 第三，本發明還提供了一種用于檢測嗜水氣單胞菌的試劑盒，所述試劑盒包括上 述的5種序列作為引物、dNTP、Bst DNA聚合酶、甜菜堿、MgSO4、以及恒溫擴增緩沖液。本發 明提供的試劑盒可以應用常規的交叉恒溫擴增技術的試劑和反應常數技術擴增。
[0026] 發明人建立了 CPA技術對嗜水氣單胞菌的檢測方法。通過對CPA檢測和qPCR檢 測進行比較，我們發現CPA檢測無論在檢測靈敏度上還是在對樣本的檢測能力上都與qPCR 相一致。但是qPCR技術的檢測成本較高，需要精密昂貴的熱循環儀器，且對實驗環境和操 作者的技術也有嚴格的要求，因此限制了該技術的普遍適用性，不利于在農村地區以及基 層實驗室的推廣應用。而CPA技術設備簡單，易操作，其反應只需要一個普通的水浴鍋或者 恒溫裝置，不需要昂貴的PCR儀，易于在基層實驗室和農村地區推廣應用。一般情況下，以 分子水平為基礎的檢測方法例如PCR和qPCR都會受臨床標本中抑制物的影響，一些研宄者 報導CPA使用的Bst聚合酶對樣品中抑制物的耐受能力比qPCR中的Taq酶要強，因此CPA 技術具有更廣闊的臨床應用前景。
[0027] 總之，本研宄建立的CPA方法是首次將CPA技術運用到了嗜水氣單胞菌的檢測，該 方法在Ih內就可以觀察結果，滿足了臨床快速診斷的需要。在以常見的致病菌及條件致病 菌DNA為模板評價CPA反應體系的特異性的實驗中，該體系在檢測33種其他常見致病菌和 機會致病菌時未出現特異性擴增，說明該檢測體系的特異性良好。CPA方法擴增反應條件簡 單，溫度單一、反應及結果研判快速，所需儀器設備簡單，可作為一種快速的篩查方法在臨 床檢驗檢疫、基層實驗室及農村地區進行大規模的推廣使用。
【附圖說明】
[0028] 圖I. CPA檢測desA基因的引物設計位置和方向不意圖；
[0029] 圖2. CPA對質粒標準品檢測的靈敏度評價濁度分析圖；
[0030] 圖3. CPA對質粒標準品檢測的靈敏度評價電泳分析圖；
[0031] 圖4. CPA對質粒標準品檢測的靈敏度評價焚光目測圖；
[0032] 圖5. CPA對模擬標本檢測的靈敏度評價濁度分析圖。
【具體實施方式】
[0033] 下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而 更為清楚。但這些實施例僅是范例性的，并不對本發明的保護范圍構成任何限制。
[0034] 本發明實施例所用標準菌株購自中國藥品生物制品檢定所，其他菌株分離自食 品、糞便和嘔吐物等樣品，均經德靈WALKAWAY-40SI全自動微生物分析儀鑒定。用于特異性 評價的菌株見表2。
[0035] 序列設計
[0036] 根據嗜水氣單胞菌特異性基因 desA設計交叉反應引物。desA基因編碼一種外膜 蛋白受體，可以從環境中攝取細菌生長和存活所必需的鐵元素。我們利用多序列比對軟件 ClustalX 1. 83對嗜水氣單胞菌的參考菌株進行desA基因的序列比對，在該基因的保守區 域使用引物設計軟件Primer Premier 5.0設計交叉反應引物，并將設計的引物在NCBI數 據庫中進行序列比對分析，以排除引物與其他物種序列可能