載體克隆表達區基因和蛋白分泌型哺乳動物細胞表達載體的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因重組和蛋白表達領域，具體說是一種蛋白分泌型哺乳動物細胞表 達載體克隆表達區基因的設計及其應用，構建成一種新型的蛋白分泌型哺乳動物細胞表達 載體 pcDNA3. 1-secreting。
【背景技術】
[0002] 眾所周知，大量哺乳動物來源的蛋白都是糖蛋白，這類蛋白在表達過程中需要翻 譯后修飾。因此，如以基因工程技術來大量制備此類蛋白，原核宿主細胞如細菌細胞等是不 適合的。由于這個原因，研究者開發了利用高等真核細胞(如哺乳動物細胞）的蛋白表達系 統。然而，以哺乳動物細胞表達的蛋白，其生產和回收技術存在的主要問題是這些蛋白主要 被表達于細胞質內，而不能分泌到細胞外空間，因此后續對這些蛋白的純化必須先裂解細 胞，然后經幾步程序使所表達的目的蛋白與其它胞內蛋白分離。解決這個問題的方法之一 是使表達的重組蛋白能夠分泌到細胞外的培養基中。這樣可以較為容易而有效地進行純 化。此外，分泌產生的重組蛋白的另一個優點是可避免被蛋白酶水解并且蛋白質正確折疊 的機會更大。蛋白質的成功分泌要求蛋白質能有效穿越內質網膜和細胞膜。這就需要在要 表達的目的蛋白氨基端連接一段附加的肽序列，此附加序列可使其后融合的目的蛋白分子 進入分泌通路。此附加肽序列被稱為信號肽序列。
[0003] 載體pcDNA3. 1載體是一種可在哺乳動物細胞中表達外源蛋白的表達載體，其高 效的CMV啟動子，可在多種哺乳動物細胞中被高效激活，用于多種真核生物蛋白的表達。但 是pcDNA3. 1載體缺乏有效信號肽序列，不能將表達的蛋白質分子分泌到細胞外，這對于后 續對表達的蛋白的提取和分離造成嚴重不便。本發明在大量生物信息學模擬分析，多種序 列組合的設計和實際生物學活性篩選結果的基礎上，對pcDNA3. 1載體進行改造，設計并合 成一種載體克隆表達區基因，構建了一種新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting,該載體可使 編碼基因連接于多克隆位點處的外源蛋白在哺乳動物宿主細胞中以胞外分泌的形式表達 出來，分泌于細胞培養液中，便于收集和純化。
【發明內容】
[0004] 本發明的目的是設計一種蛋白分泌型哺乳動物細胞表達載體克隆表達區基因及 其應用，獲得一種能夠有效的將外源蛋白分泌表達到細胞外培養基中的新型哺乳動物細胞 表達載體 pcDNA3. 1-secreting。
[0005] 為實現上述目的，本發明采用的技術方案為：
[0006] 設計并合成載體克隆表達區基因，其具有序列表SEQ ID NO :1中堿基序列；
[0007] SEQ ID NO ： 1
[0008] GGCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGC 40
[0009] TTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGCAAGCTT 72
[0010] 利用限制性核酸內切酶Nhe I和Hind III的酶切連接技術，將合成的載體克隆表 達區基因(序列表SEQ ID NO :1中堿基序列）整合入表達載體pcDNA3. 1克隆表達區，構建成 新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting。該載體可使編碼基因連接于多克隆位點處的外源蛋白 在哺乳動物宿主細胞中以胞外分泌的形式表達出來，分泌于細胞培養液中，便于收集和純 化。
[0011] 本發明具有如下優點：
[0012] 1.本發明構建的新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting,在緊鄰啟動子下游區添加 了高效的分泌信號肽序列，可使克隆于下游的外源編碼基因表達的蛋白分子分泌到細胞外 培養基中，既方便了后續的純化提取，省略了細胞破碎的過程；又避免表達的外源蛋白在細 胞內被胞內蛋白酶水解，因此可以顯著提高蛋白表達效率。
[0013] 2.本發明構建的新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting,在啟動子下游和多克隆位 點上游添加了 ATG起始密碼子和Kozak序列，Kozak序列可以極大提商基因轉錄后的蛋白 翻譯效率。因此以本發明所構建的載體在哺乳動物細胞中行進外源蛋白表達時，無需再于 編碼基因中額外添加 ATG和Kozak序列，大大的簡化了外源基因片段亞克隆至本載體的過 程。
[0014] 3.本發明構建的新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting,盡可能地保留了原載體的 pcDNA3. 1的多克隆位點區的限制性內切酶識別序列，方便外源基因片段的連接和插入。
【附圖說明】
[0015] 圖1為酶聯免疫吸附法（ELISA)檢測的原有pcDNA3. 1(+)載體和本發明中的 pcDNA3. Ι-secreting載體在HEK293細胞中表達重組人IL-6 (rhIL-6)蛋白片段的結果， 白框部分為細胞培養基中的rhIL-6含量，灰框部分為細胞破碎后細胞質中的rhIL-6含量。 由圖可知，以pcDNA3. 1 (+)載體在HEK293細胞中表達的rhIL-6,基本分部于細胞質中，而培 養基中含量極低；而以本發明中構建的新型表達載體pcDNA3. Ι-secreting在HEK293細胞 中表達的rhIL-6,可以被有效的分泌到細胞培養基中，便于后續的分離與純化。
【具體實施方式】
[0016] 實施例1
[0017] 載體克隆表達區基因的制備，其具有序列表SEQ ID NO : 1中所不的喊基序列：
[0018] (I) SEQ ID NO. 1的信息（參見序列表）
[0019] (a)序列特征：
[0020] *長度：72堿基對
[0021] *類型：核酸
[0022] *鏈型：雙鏈
[0023] *拓撲結構：線性
[0024] (b)分子類型：寡聚核苷酸鏈
[0025] (C)假設：否
[0026] (d)反義：否
[0027] (e)最初來源：設計并人工合成
[0028] (2)載體克隆表達區基因的制備
[0029] 1)載體克隆表達區基因的設計合成：
[0030] 根據構建新型表達載體的預期目的，設計并合成兩條寡聚核苷酸鏈：正向鏈P-F:
[0031] 5 ' -GCTAGATGAGAGTTCCTCCTCAATTTCTGGGCTTGCTGCTTTTGTGGCTTCCCGGGGTGAGGTGC A-3,；
[0032] 反向鏈 p-R:
[0033] 5 ' -AGCTTGCACCTCACCCCGGGAAGCCACAAAAGCAGCAAGCCCAGAAATTGAGGAGGAACTCTCAT
[0034] 2)寡聚核苷酸鏈的退火：
[0035] IOX退火雜交緩沖液（SSC)成分：1. 5mol/LNaCl
[0036] 0· 3M 檸檬酸三鈉· 2H20，
[0037] 以 HCl 調 pH 至 7. 0
[0038] 退火反應體系：
[0039] 10XSSC buffer 1 μ I
[0040] 正反寡聚核苷酸鏈各5pmol
[0041] 無菌超純水 補齊體