一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學領域，尤其涉及一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法。
【背景技術】
[0002] 癌癥是人類健康的三大殺手之一，每年因惡性腫瘤導致死亡的人數有逐年增加的 趨勢。現有的腫瘤疾病的治療中，通常有化療、放療和手術治療幾種方式。由于腫瘤手術 有其局限性，化學療法多與手術、放療等聯合使用，增強對腫瘤細胞的殺傷作用。使用單一 藥物化療通常都不能取得理想的治療效果，因此腫瘤的治療通常采用多種化療藥物聯合應 用。然而，多藥聯合治療時，多藥耐藥是對化療藥物療效及病人康復的一大障礙。為了研宄 不同癌癥多藥耐藥的機制，就必須建立多藥耐藥的模型。由此，建立一種多藥耐藥的細胞模 型或動物模型顯得異常重要。
【發明內容】
[0003] 本發明的目的在于提供一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法，旨在解決腫瘤細 胞多藥耐藥問題。
[0004] 本發明是這樣實現的，一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法，包括以下步驟：
[0005] 提供腫瘤細胞，并進行培養；
[0006] 使用鹽酸米托蒽醌對所述腫瘤細胞進行藥物誘導，得到鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細 胞系；
[0007] 使用RNAi沉默所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系的PARPl基因。
[0008] 本發明提供的一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法，利用鹽酸米托蒽醌誘導癌 細胞形成鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系，并在所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系的基礎上 采用RNAi技術沉默多藥耐藥的關鍵基因 PARP1，建立了多藥耐藥腫瘤細胞模型，從而抑制 PARPl對DNA的修復，提高腫瘤細胞對藥物和放化療的敏感性。
【具體實施方式】
[0009] 為了使本發明要解決的技術問題、技術方案及有益效果更加清楚明白，以下結合 實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋 本發明，并不用于限定本發明。
[0010] 本發明實施例提供了一種多藥耐藥腫瘤細胞模型的構建方法，包括以下步驟：
[0011] SOL提供腫瘤細胞，并進行培養；
[0012] S02.使用鹽酸米托蒽醌對所述腫瘤細胞進行藥物誘導，得到鹽酸米托蒽醌誘導耐 藥細胞系；
[0013] S03.使用RNAi沉默所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系的PARPl基因。
[0014] 具體的，上述步驟SOl中，所述腫瘤細胞的選用不受限制，任何腫瘤細胞均可以用 于本發明實施例中用作構建多藥耐藥腫瘤細胞模型。優選的，本發明實施例可采用MCF7細 胞（人乳腺癌細胞）來構建多藥耐藥腫瘤細胞模型。
[0015] 上述步驟S02中，使用鹽酸米托蒽醌對所述腫瘤細胞進行藥物誘導，可以得到鹽 酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系。為了獲得效果誘導效果較好的鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞 系，作為優選實施例，使用終濃度為〇. 005-0. 04 μM的所述鹽酸米托蒽醌對所述腫瘤細胞 進行染毒，誘導耐藥。進一步的，優選使用終濃度為〇. 02 μ M的所述鹽酸米托蒽醌對所述腫 瘤細胞進行染毒，誘導耐藥。
[0016] 為了比較藥物誘導的效果，可選用不同濃度的鹽酸米托蒽醌平行對照組對所述腫 瘤細胞進行藥物誘導，同時設立野生型空白對照組。作為具體實施例，將鹽酸米托蒽醌粉 末配置成5 μ mol/L的母液，進行稀釋處理分別得到終濃度為0. 005 μ M、0. 01 μ Μ、0. 02 μ Μ、 0. 04 μ M的鹽酸米托蒽醌平行組。各平行組分別選用5 μ L、10 μ L、20 μ L、40 μ L體積的米托 蒽醌依次對所述腫瘤細胞如MCF-7細胞進行染毒，誘導耐藥。24h換液一次，并繼續染毒； 傳代時停藥，貼壁后再染毒。持續染毒30天后，對每個完成誘導階段的細胞，在倒置顯微鏡 下觀察細胞形態變化，拍照，并于液氮中凍存保種備用。
[0017] 本發明實施例中，為了檢測所述鹽酸米托蒽醌對所述腫瘤細胞的藥物誘導效果， 可對獲得的腫瘤細胞進行耐藥性檢查。作為具體實施例，采用流式細胞術檢測經所述鹽酸 米托蒽醌誘導后的腫瘤細胞的耐藥性，具體操作如下：
[0018] Q01.將所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系停藥培養兩周后，將所述野生型空白對 照組及各所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系分別接種到六孔板上；
[0019] Q02.待細胞融合到70-80%時，加入終濃度為3 μΜ的帶熒光的米托蒽醌，放入培 養箱中培養l_4h，更優選為2h，為了防止所述米托蒽醌所帶的熒光淬滅，進行避光處理；
[0020] Q03.使用PBS洗滌上述培養的細胞后，換液，繼續培養Ih，避光處理；
[0021] Q04.采用胰酶消化處理后收集細胞，PBS懸浮，吹打成單個細胞，避光；
[0022] Q05.上機，檢測。
[0023] 作為本發明另一個具體實施例，可以采用Western blotting檢測鹽酸米托蒽醌誘 導耐藥細胞系，具體操作可參照如下：
[0024] WOL所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞總蛋白的提取：倒掉培養液，用預冷的PBS 漂洗兩次，用移液器槍吸干凈殘留的PBS。將處理后的樣品置于冰上，加入細胞裂解液，裂解 處理30min。所述裂解處理結束后，用干凈的刮棒將細胞刮于培養瓶的一側，用槍吸取裂解 液移到離心管中進行離心處理。作為具體優選實施例，所述離心處理在4°C下12000rpm離 心25min。將離心后的上清液分裝后置于-20°C條件下保存。
[0025] W02. SDS-PAGE :配制10 %的分離膠，5 %的濃縮膠，取出所述上清液樣品至離心管 中，加入5XSDS緩沖液至終濃度為IX，混勻后加熱處理使蛋白質變性。作為具體實施例， 可采用加熱器98°C條件下煮5min。將所述分離膠、濃縮膠連同膠板一起放入電泳槽，加入 IX電泳緩沖液，電泳緩沖液加至漫過加樣孔后開始上樣。上樣量在15-20 μ L，再在膠的兩 側分別加入3 μ L的蛋白maker。所述電泳的條件優選為：濃縮膠80V，30min ;分離膠120V， lh，電泳至溴酚藍剛跑出即可終止電泳。
[0026] W03.轉膜：電泳結束后，剪2張與分離膠大小相同的濾紙和1張硝酸纖維素膜， PVDF硝酸纖維膜先用甲醇浸泡Imin左右，再放入半干轉膜浸泡5min。濾紙放入半干轉膜 液里浸泡。自下而上依次疊放濾紙、膜、凝膠、濾紙（3層），避免產生氣泡。電轉移時電流一 塊膠電流38mA轉印2h。
[0027] W04.封閉：將轉移后的PVDF膜放入封閉液中，常溫下，2h，或4°C封閉過夜。
[0028] W05.免疫反應：封閉結束后，剪取所需條帶，加入封閉液，孵一抗內參GAPDH以 1:2000比例稀釋，MBDs以1:300稀釋。加入一抗后4°C孵育過夜。一抗過夜后，加 TBST洗 膜三次，每次l〇min。孵二抗，內參GAPDH與封閉液1:3000稀釋比例，加入封閉液，取所述二 抗，放在搖床上Ih孵育。二抗孵育結束后，同樣加 TBST洗膜三次，每次lOmin。
[0029] W06.化學發光，顯影：按照ECL試劑盒說明書，將化學發光劑的A液和B液等量混 合。把洗好的條帶現在濾紙上過一下，吸取掉過多的液體，再按方向平放在板上，防止產生 氣泡，再用發光液覆蓋條帶，并左右混勻，開始顯影。
[0030] 經過上述步驟S02所述鹽酸米托蒽醌誘導后，耐藥細胞中存在大量活化狀態 PARP-I，所述PARP-I可啟動DNA修復功能，降低腫瘤細胞對藥物和放化療的敏感性。有鑒 于此，本發明實施例步驟S03中，使用RNAi沉默所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系的PARPl 基因，從而降低PARP-I的活度，抑制DNA修復功能，進而提高腫瘤細胞對多藥放化療的敏感 性。
[0031] 具體的，上述步驟S03使用RNAi沉默所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系的PARPl 基因包括以下步驟：
[0032] S031.設計合成 shRNA ;
[0033] S032.使用shRNA核苷酸鏈進行慢病毒包裝；
[0034] S033.使用所述慢病毒感染所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系。
[0035] 進一步的，本發明實施例上述步驟S031中，shRNA序列的設計，是本發明實施例的 重點，關系到所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系進一步產生多藥耐藥性的成敗因素。為了 高效地產生RNAi效應，抑制PARPl基因表達，在所述使用RNAi沉默所述鹽酸米托蒽醌誘導 耐藥細胞系的PARPl基因的步驟中，使用shRNAl、shRNA2、shRNA3三種shRNA核苷酸鏈進行 慢病毒包裝，感染所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系。本發明實施例通過對PARPl靶mRNA 序列二級結構的研宄，獲取3條19nt靶序列。在此基礎上，針對3條19nt靶序列，設計合 成了相應的shRNA。作為優選實施例，所述shRNAl、shRNA2、shRNA3核苷酸鏈序列包含六個 區域，分別為：BamH I酶切位點、19nt靶核苷酸序列、莖環結構（TTCAAGAGA)、靶序列互補序 列、RNA Poly III聚合酶轉錄中止位點（TTTTTT)和EcoR I酶切位點。該優選設計的shRNA， 可高效地產生RNAi效應，從而有效抑制PARPl基因表達，降低PARPl活度，進而達到抑制 DNA修復功能、并提高腫瘤細胞對多藥放化療敏感性的目的。作為本發明對照，同時設計了 一對對照序列siRNAc，并根據對照序列siRNAc設計合成了 shRNAc。
[0036] 作為具體優選實施例，所述shRNAl、shRNA2、shRNA3和shRNAc核苷酸鏈的序列分 別為：
[0037] shRNAl Top ：
[0038] 5 ' -gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0039] shRNAl Bottom:
[0040] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTG Cg-3' ；
[0041] shRNA2 Top ：
[0042] 5 ' -gatccGCAACAAACTGGAACAGATTTCAAGAGAATCTGTTCCAGTTTGTTGCTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0043] shRNA2 Bottom ：
[0044] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAAGCAACAAACTGGAACAGATTCTCTTGAAATCTGTTCCAGTTTGTTG Cg-3' ；
[0045] shRNA3 Top ：
[0046] 5 ' -gatccGCGAGTACATTGTCTATGATTTCAAGAGAATCATAGACAATGTACTCGTTTTTTACGCG Tg-3'，
[0047] shRNA3 Bottom ：
[0048] 5 ' -aattcACGCGTAAAAAACGAGTACATTGTCTATGATTCTCTTGAAATCATAGACAATGTACTCG Cg-3' ；
[0049] shRNAc Top ：
[0050] 5' -ccggtGCTTCGACATTTAACCAATTTCAAGAGAATTGGTTAAATGTCGAAGCTTTTTTg-3'，
[0051] shRNAc Bottom ：
[0052] 5' -aattcAAAAAAGCTTCGACATTTAACCAATTCTCTTGAAATTGGTTAAATGTCGAAGCa-3'。
[0053] 該優選的所述shRNAl、shRNA2、shRNA3核苷酸鏈序列，用于后續慢病毒包裝并轉 染所述鹽酸米托蒽醌誘導耐藥細胞系后，可高效產生RNAi效應，從而有效抑制PARPl基因 表達，降低PAR