一種誘導多能性干細胞的培養體系的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，涉及一種誘導多能性干細胞的培養體系，具體地，本發 明涉及一種誘導多能性干細胞的培養體系，其制備方法及其應用。
【背景技術】
[0002] 小鼠胚胎干細胞（embryonic stem cell, ES)和人胚胎干細胞的建立開創了生物 和醫學的新領域，胚胎干細胞以自我更新和向各個胚層細胞分化的能力為研究個體發育和 細胞分化提供了有力的工具，并在再生醫學和組織工程領域具有廣闊的應用前景，很快就 應用于細胞治療和疾病模型研究，它可以為人類無法自身修復的疾病（帕金森，糖尿病等） 提供組織再生的替代細胞。
[0003] 豬的胚胎干細胞的建立將對農業生產和生物醫學起著至關重要的作用。但是目前 為止還沒有一株被承認的豬胚胎干細胞系被建立。在這近20年的豬胚胎干細胞研究過程 中，大家在一直探索和追尋怎樣才能建立出豬的胚胎干細胞并且解釋豬胚胎干細胞無法容 易建立的原因。最成功的豬胚胎干細胞系是在1990年被Evan等人建立，可以傳10代左右， 但之后會呈現上皮樣細胞的生長。之后經過了一系列的努力，但沒有一株胚胎干細胞系被 認可，分化能力較差，更沒有嵌合能力。雖然有報道豬的依賴于Activin/Nodal信號通路的 上胚層干細胞系被建立，但是無論是分子標記的表達還是分化能力都不是很明確。
[0004] 在沒有成功的細胞系被建立時，大家都在猜測各種各樣的原因，比如豬胚胎的發 育時程問題，豬胚胎的著床問題，合子基因問題，多能性基因表達和飼養層等問題，但是這 一切都沒有好的解決手段或是針對性的分析方法，一切還是停留在描述的階段。
[0005] 自小鼠誘導多能性干細胞（induce pluripotent stem cells, iPS)細胞建立之 后，人們在想是否可以通過外源基因導入的手段來建立豬的多能性干細胞系。2009第一株 豬iPS細胞系被建立，之后得到多個實驗室的重復，但是分子表達標記有些差異，尤其是針 對SSEAl和SSEA4,但令人失望的是外源基因的表達是維持多能性狀態所必須的，雖然有報 道可以進行嵌合體實驗，至今卻沒有得到其他實驗室的重復。更令人奇怪的是豬iPS細胞 的核移植胚胎發育率遠遠低于正常的體細胞，并且克隆胚胎的體內發育率更是極低，極少 的胎兒能夠正常出生。
[0006] 雖然很多實驗室進行了小分子的添加來誘導多能性干細胞。但是效果不甚理想， 針對上述問題，本發明首先對誘導的培養體系的摸索和優化，能夠較高效率的獲得豬iPS， 并且這些豬iPS更傾向于小鼠樣的克隆，可以單個細胞傳代，有較高的發育潛能和更好的 轉基因效率。由于小鼠，猴子和人的細胞也存在誘導效率較低的問題，因此，當前存在能誘 導多能性干細胞并提高其誘導效率的培養基的需要。
【發明內容】
[0007] 因此，本發明的一個目的是提供一種用于誘導多能性干細胞的培養基，本發明的 另一個目的是提供該培養基的制備方法及其應用。
[0008] -方面，本發明提供了一種用于誘導多能性干細胞的培養基，所述培養基為LBX 液體培養基，包括氨基酸、維生素、無機鹽及其它組分；
[0009] 其中，所述氨基酸包括50-150mg/L的L-精氨酸鹽酸鹽、10-20mg/L的L-組氨酸鹽 酸鹽一水物、25-50mg/L的L-異亮氨酸、25-50mg/L的L-亮氨酸、40-80mg/L的L-賴氨酸鹽 酸鹽、7-15mg/L的L-蛋氨酸、18-40mg/L的L-苯丙氨酸、17-40mg/L的L-絲氨酸、17-60mg/ L的L-蘇氨酸、2-8mg/L的L-色氨酸、15-50mg/L的L-酪氨酸二鈉鹽和10-60mg/L的L-纈 氨酸；
[0010] 所述維生素包括0. 5_8mg/L的氯化膽堿、0. 5_5mg/L的D-泛酸鈣、0. 5_4mg/L的葉 酸、0· 5-4mg/L的煙酰胺、0· 5-4mg/L的鹽酸批卩多醇、0· 05-lmg/L的核黃素、0· 5-4mg/L的鹽 酸硫胺素和l-l〇mg/L的肌醇；
[0011] 所述無機鹽包括30-100mg/L的無水氯化鈣、2-30mg/L的無水硫酸鎂、80-300mg/L 的氯化鉀、300_1000mg/L的碳酸氫鈉、1000-5000mg/L的氯化鈉和20-100mg/L的磷酸二氫 鈉；
[0012] 所述其它組分包括500-2000mg/L的D-葡萄糖、500-2000mg/L的羥乙基哌嗪乙磺 酸、0. 005-0. lmg/L 的辛硫酸、50-400mg/L 的腐胺、100-600mg/L 的丙酮酸鈉、0. 04-0. 40mg/ L的胸苷、4-50mg/L的L-肉堿、2000-20000mg/L的人轉鐵蛋白、0· 2-3mg/L的孕酮、 0· 05_2mg/L的亞硒酸鹽鈉、2_80mg/L的乙醇胺、50_400mg/L的D-半乳糖、40_400mg/L的 過氧化氫酶、2_40mg/L的谷胱甘肽、4-80mg/L的超氧化物歧化酶、30-400mg/L的視黃醇、 30-400mg/L的視黃醇乙酸酯、300-4000mg/L的維生素 E、300-4000mg/L的維生素 E醋酸酯、 0. 05-0. 5mg/ml的牛血清白蛋白、0. 5-5 μ g/ml的胰島素、500-4000U/ml的白血病抑制因子 和4-100ng/ml的堿性成纖維細胞生長因子；
[0013] 優選地，所述氨基酸還包括以下氨基酸中的一種或多種：10-50mg/L的甘氨酸、 2-40mg/L的L-丙氨酸、0· 83-50mg/L的L-天冬酰胺一水合物、6-50mg/L的L-天冬氨酸、 l-20mg/L的L-半胱氨酸、4-100mg/L的L-半胱氨酸鹽酸鹽一水物、4-30mg/L的L-半胱氨 酸二鹽酸鹽、5-70mg/L的L-谷氨酸、7-100mg/L的L-脯氨酸；
[0014] 優選地，所述維生素還包括以下維生素中的一種或多種：0. 5_4mg/L的維生素 H、 0-10mg/L的維生素 bl2 ;
[0015] 優選地，所述無機鹽還包括以下無機鹽中的一種或多種：0-0.001mg/L的五水 硫酸銅、〇-〇. 〇lmg/L的九水硝酸鐵、0-0. 5mg/L的七水硝酸鐵、0-50mg/L的無水氯化鎂、 4-50mg/L的無水磷酸氫二鈉、〇-5mg/L的七水硫酸鋅；
[0016] 優選地，所述其他組分包括以下的一種或多種：0. ι-lmg/L的次黃嘌呤鈉、 400-2000mg/L 的亞油酸、0-5mg/L 的酚紅、0. 005-0. 05mg/L 的腐胺二鹽酸、0-3000mg/L 的亞 麻酸、0. 4-4mM的L-谷酰胺、20-200 μ g/ml的鏈霉素溶液、20-200U/mL的青霉素、0-0.1 mM 的@-硫基乙醇、0.5-5以1的轉化生長因子抑制劑（58431542)、0.5-3以11絲裂原活化蛋白 激酶抑制劑（？〇〇3259〇1)、1-1(^11的肝糖原合成激酶3 0(651(3 0)受體的選擇性抑制劑 (CHIR99021)、10-200ng/ml 的維生素 C ;
[0017] 進一步優選地，所述LBX液體培養基包括下表所述的組分：
[0018]
[0019]
[0020]
[0021] 優選地，所述干細胞為豬干細胞、小鼠干細胞、猴干細胞或人干細胞。
[0022] 更優選地，所述干細胞為豬干細胞。
[0023] 本發明的培養基配制方法如下：
[0024] 1)根據配制的總體積，計算好所需各類組分的量；
[0025] 2)將上述組分中的水溶性組分直接溶于滅菌的去離子水中，攪拌均勻；
[0026] 3)其它不溶于水的組分溶于微量的DMSO中；其中，使用的DMSO的量不超過所述 總體積的〇. 5% ;
[0027] 4)將步驟2)和步驟3)得到的溶液混合均勻后，定容到所述的總體積；使用濾器 過濾即得。優選地，所述濾器為0.22微米的濾器。
[0028] 另一方面，本發明提供一種誘導多能干細胞的方法，所述方法使用上述培養基。
[0029] 優選地，所述方法包括以下步驟：將已導入多能性相關基因的供體細胞制備為單 細胞懸液，并使用上述培養基誘導ips細胞。
[0030] 更優選地，所述方法包括以下步驟：
[0031] 1)將已導入多能性相關基因的供體細胞接種到飼養層細胞上；
[0032] 優選地，所述供體細胞為成纖維細胞，更優選地，所述供體細胞為豬成纖維細胞、 小鼠成纖維細胞、猴成纖維細胞或人成纖維細胞；
[0033] 優選地，所述多能性相關基因為Klf4、Sox2、Nanoge和0ct4 ;
[0034] 優選地，供體細胞與飼養層細胞的數量比優選為1 :6_9,更優選為I :8 ;
[0035] 優選地，使用胰酶將供體細胞消化成單細胞，優選地，所述胰酶的濃度為 0.25g/100mL ；
[0036] 優選地，所述飼養層細胞為小鼠成纖維細胞；
[0037] 2)將步驟1)中接種好的細胞使用10%DMEM的培養液培養1