、10 μ g/mL胰島素、50nmol/L氫化可的松、20nmol/LWNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL牛血清白蛋白、35ng/mL纖連蛋白、50ng/mL四型膠原蛋白。
[0042]培養基制備方法為:使用時按照規定量將所有成分混合均勻。
[0043]實施例2培養基的制備
[0044]培養液配方成分為:DMEM/F12、15 ymol/mL非必需氨基酸、20ng/mL表皮生長因子、5ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、15 μ g/mL胰島素、60nmol/L氫化可的松、10nmol/LWNT3a、50nmol/L Notchl、60 μ g/mL牛血清白蛋白、15ng/mL纖連蛋白、60ng/mL四型膠原蛋白。
[0045]培養基制備方法為:使用時按照規定量將所有成分混合均勻。
[0046]實施例3培養基的制備
[0047]培養液配方成分為:DMEM/F12、20 ymol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生長因子、10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 μ g/mL胰島素、40nmol/L氫化可的松、15nmol/LWNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL牛血清白蛋白、25ng/mL纖連蛋白、70ng/mL四型膠原蛋白。
[0048]培養基制備方法為:使用時按照規定量將所有成分混合均勻。
[0049]實施例4本發明培養基培養神經細胞實例
[0050]出生I?4天的新生小鼠，脫頸處死后取新生小鼠大腦，剝去腦膜后用4°C PBS清洗2次，加入2mL神經干細胞培養液(試驗組I采用實施例1培養基，試驗組2采用實施例2培養基，試驗組3采用實施例3培養基)，并用手術剪將大腦剪碎，接著用ImL手動移液器將碎片吹散成混懸液，然后調整細胞密度到5 X 104/mL。將混懸液加入6孔板，每孔2mL在5 % CO2、37 °C培養箱中放置2小時，2小時后吸取6孔板中的上清液，加入另一個6孔板中繼續培養，原6孔板棄去不要。培養24小時后棄去6孔板中的上清液，每孔加入2mL神經干細胞培養液(試驗組I采用實施例1培養基，試驗組2采用實施例2培養基，試驗組3采用實施例3培養基)，之后每2?3天換液一次。直到細胞融合度達到80%時倒去培養基并用含0.04v/v% EDTA的濃度為0.25v/v%的胰蛋白酶消化細胞I分鐘，使其脫落，然后用各組所用培養基按照加入胰酶體積的5倍終止消化；離心后去除上清液，將沉淀細胞用各組所用培養基重懸，按照5 X 104/mL的密度加入培養瓶中，標記為Pl代細胞。重復傳代至P6代。
[0051]將上述各組培養的神經干細胞進行流式檢測，在P6代的標志物Nestin+、⑶133+的流式檢測數據見圖1?3。
[0052]各組培養的神經干細胞生長曲線見圖4?6。
[0053]由圖1?3可知，與傳統培養基相比，本發明實施例1至3的培養基能夠使P6代的神經干細胞的表面標志物Nestin+、⑶133+的比例能夠達到33.3%,29.5%,24.3%，而傳統培養基在P6代的Nestin+、CD133+的比例僅為9.8% (圖7)。
[0054]一般增殖能力強的細胞，生長曲線會呈“S”型，可分為3個生長時期:第一階段為適應期，細胞增殖較慢:第二階段為對數生長期，細胞增殖速度變快，呈對數生長；第三階段為平臺期，細胞增殖減緩。根據神經干細胞P6代七天的細胞生長曲線圖(圖4?6)，可看到O?2天為適應期，3?6天為對數生長期，細胞增殖較快，第7天細胞增殖變慢，進入了平臺期。細胞生長曲線圖可知，該細胞的增殖能力較強。而采用傳統培養基培養的神經干細胞的生長曲線顯示細胞生長緩慢，無明顯對數增殖(圖8)。
[0055]可見，本發明提供的神經干細胞培養基能夠大大增強神經干細胞的增殖能力。
[0056]同時本發明的培養基能夠使得神經干細胞在不用明膠預鋪板的情況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產流程。
[0057]對比例I傳統培養基培養神經細胞實例
[0058]傳統培養基是指GIBCO的Neurobasal培養基+1 % B27添加物。培養基配制方法為:將Neurobasal培養基和B27添加物混合，比例為500mL培養基+5mLB27添加物。
[0059]鋪板:將0.1 % (質量體積分數)的明膠加入6孔板中，加入量為每孔ImL明膠，將明膠搖勻使之鋪滿培養瓶底部，將6孔板放入37°C培養箱中靜置I小時備用。
[0060]細胞分離:出生1-4天的新生小鼠，脫頸處死后取新生小鼠大腦，剝去腦膜后用40C PBS清洗2次，加入2mL傳統培養基并用手術剪將大腦剪碎，接著用ImL手動移液器將碎片吹散成混懸液，然后調整細胞密度到5 X 104/mL。將混懸液加入已經鋪板的6孔板種，每孔2mL，在5% CO2、37°C培養箱中放置2小時，2小時后吸取6孔板中的上清液，加入另一個已經鋪板的6孔板中繼續培養，原6孔板棄去不要。培養24小時后棄去6孔板中的上清液，每孔加入2mL培養液A，之后每2?3天換液一次。
[0061]傳代:直到細胞融合度達到80%時倒去培養基并用含0.04v/v% EDTA的濃度為
0.25v/v%的胰蛋白酶消化細胞I分鐘，使其脫落，然后用培養基A按照加入胰酶體積的5倍終止消化；離心后去除上清液，將沉淀細胞用本發明培養基重懸，按照5X104/mL的密度加入培養瓶中，標記為Pl代細胞。重復傳代至P6代。
[0062]將上述培養的神經干細胞進行流式檢測，在P6代的標志物Nestin、⑶133+的流式檢測數據見圖7。培養的神經干細胞生長曲線見圖8。
[0063]由圖7可知，傳統培養基在P6代的Nestin+、⑶133+的比例僅為9.8%。采用傳統培養基培養的神經干細胞的生長曲線顯示細胞生長緩慢，無明顯對數增殖(圖8)。可見，本發明提供的神經干細胞培養基能夠大大增強神經干細胞的增殖能力。
[0064]以上所述僅是本發明的優選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發明的保護范圍。
【主權項】
1.一種神經干細胞培養基，其特征在于，包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、胰島素、氫化可的松、WNT3a、Notchl和牛血清白蛋白。2.根據權利要求1所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基中含有10?20 μmol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生長因子、5?15ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10?20 μ g/mL胰島素、40?60nmol/L氫化可的松、10?20nmol/LWNT3a、40 ?60nmol/L Notchl、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白。3.根據權利要求2所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基中含有10 μ mol/mL非必需氨基酸、15ng/mL表皮生長因子、15ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10 μ g/mL 膜島素、50nmol/L 氛化可的松、20nmol/L WNT3a、40nmol/L Notchl、50 μ g/mL牛血清白蛋白。4.根據權利要求2所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基中含有15 4!1101/1111^非必需氨基酸、201^/1111^表皮生長因子、51^/111]^堿性成纖維細胞生長因子、15 μ g/mL 膜島素、60nmol/L 氛化可的松、10nmol/L WNT3a、50nmol/L Notch 1、60 μ g/mL 牛血清白蛋白。5.根據權利要求2所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基中含有20 μ mol/mL非必需氨基酸、10ng/mL表皮生長因子、10ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、20 μ g/mL 膜島素、40nmol/L 氛化可的松、15nmol/L WNT3a、60nmol/L Notchl、40 μ g/mL牛血清白蛋白。6.根據權利要求1至5中任一項所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基還包括纖連蛋白和四型膠原蛋白。7.根據權利要求6所述的神經干細胞培養基，其特征在于，所述神經干細胞培養基中含有10?20 μ mol/mL非必需氨基酸、10?20ng/mL表皮生長因子、5?15ng/mL堿性成纖維細胞生長因子、10?20 μ g/mL胰島素、40?60nmol/L氫化可的松、10?20nmol/LWNT3a、40 ?60nmol/L Notch 1、40 ?60 μ g/mL 牛血清白蛋白、15 ?35ng/mL 纖連蛋白、50 ?.70ng/mL四型膠原蛋白。8.—種神經干細胞貼壁培養方法，其特征在于，采用如權利要求1至7中任一項所述的神經干細胞培養基培養神經干細胞。9.根據權利要求8所述的培養方法，其特征在于，所述培養的條件為5%CO 2、37°C。10.根據權利要求8或9所述的培養方法，其特征在于，所述培養的細胞密度為.5 X 14?IXlOVmL0
【專利摘要】本發明涉及細胞培養技術領域，特別涉及一種神經干細胞培養基及神經干細胞貼壁培養方法。該神經干細胞培養基包括DMEM/F12、非必需氨基酸、表皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子、胰島素、氫化可的松、WNT3a、Notch1和牛血清白蛋白。本發明提供的神經干細胞培養基能夠大大增強神經干細胞的增殖能力，同時能夠使得神經干細胞在不用明膠預鋪板的情況下貼壁生長，免除了繁瑣的操作步驟簡化了生產流程。
【IPC分類】C12N5/0797
【公開號】CN104928247
【申請號】CN201510390313
【發明人】陳海佳, 王一飛, 葛嘯虎, 萬樺, 王小燕, 李平
【申請人】廣州賽萊拉干細胞科技股份有限公司
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年7月2日