脊椎動物dna甲基轉移酶的dna5-甲基胞嘧啶去甲基活性的制作方法
【專利說明】脊椎動物DNA甲基轉移酶的DNA 5-甲基胞嘧啶去甲基活性 技術領域
[0001] 總體而言，本發明是關于DNA甲基轉移酶的DNA去甲基活性，及其治療與診斷的用 途。 【背景技術】
[0002] 在脊椎動物中，DNA甲基化主要發生在CpG二分體內的胞喃啶（cytosine，C)的 5-位置，且其基因組甲基化模式是由該DNA(C-5)-甲基轉移酶（或稱DNMTs)所建立/維 持。在已知的脊椎動物DNMTs中，DNMTl顯現出對半甲基化DNA的底物偏好，且維持了在 DNA復制期間的甲基化模式。在體外，DNMT3A與DNMT3B對未甲基化以及半甲基化的DNA 顯現出相等的C-5甲基化活性，且其對于起始性基因組DNA甲基化（de novo genomic DNA methylation)與早期胚胎的發育是不可或缺的。包含上述三種必要的DNMTs的脊椎動物 DNA甲基化系統對基因組DNA甲基化模式的全面與局部建立是不可或缺的，因此對基因表 達、神經可塑性、分化、致癌、印跡（imprinting)、X染色體去活化及發育的過程也是不可或 缺的。
[0003] 在2012年以前的文獻中對于脊椎動物中是否存在可以主動且直接地在DNA上將 5-mC轉換為C的酶仍是未知。
【發明內容】
[0004] 在一方面，本發明涉及一種用于鑒定測試試劑（或化合物）為DNA甲基轉移酶的 活化DNA去甲基活性的調節物的方法。該方法包括：
[0005] a)提供甲基化DNA ;
[0006] b)提供DNA甲基轉移酶；
[0007] c)在測試藥劑存在或不存在下，使該甲基化DNA與該DNA甲基轉移酶反應一段足 夠的時間，以進行去甲基反應并產生去甲基DNA產物；
[0008] d)分析去甲基反應的程度；以及
[0009] e)比較在該測試試劑存在與不存在下的去甲基反應的程度，從而由此將該測試藥 劑鑒定為該DNA甲基轉移酶的DNA去甲基活性的調節物；
[0010] 其中當去甲基反應的程度在該測試藥劑存在下較低時，該測試試劑被鑒定為該 DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的抑制劑；或當去甲基反應的程度在該測試藥劑存 在下較高時，該測試藥劑被鑒定為該DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的刺激劑。 [0011] 于本發明的一個具體實施例中，該分析步驟是通過選自由限制酶切-聚合酶連鎖 反應（restriction digestion-polymer chain reaction，PCR)分析、水解-薄層色層分 析、以抗體為基礎的分析、閃爍計數、放射攝影術、斑點印跡（dot blotting)、以液相層析為 基礎的分析以及以亞硫酸氫鈉為基礎的分析所組成的群組的技術以進行。
[0012] 于本發明的另一個具體實施例中，該去甲基反應在約為10 μΜ至IOmM的媽離子存 在下進行。
[0013] 于本發明的另一個具體實施例中，該DNA甲基轉移酶為分離的脊椎動物DNA甲基 轉移酶或重組的DNA甲基轉移酶，或存在于核萃取物中或存在于細胞萃取物中。該脊椎動 物DNA甲基轉移酶、該核萃取物，或該細胞萃取物由選自于由脊椎動物細胞培養、脊椎動物 組織、昆蟲細胞、蟲細胞、昆蟲組織、蟲組織、植物細胞、植物組織、酵母菌細胞，以及細菌細 胞所組成的群組的細胞制備。其中該核萃取物可為精子萃取物。
[0014] 在本發明的另一個具體實施例中，該甲基化DNA包含經標記的甲基基團。所述甲 基化DNA內的該甲基基團可為經放射性標記。
[0015] 于本發明的另一個具體實施例中，前述方法的步驟（a)至（d)包含下列技術特征： 其中，
[0016] (a)在步驟（a)中所提供的該甲基化DNA為可操作地連接于組成型啟動子的甲基 化報道基因且存在于細胞內；
[0017] (b)在步驟（b)中所提供的該DNA甲基轉移酶為可操作地連接于組成型啟動子且 也存在于該細胞內，或內生地存在于該細胞內，作為內生的DNA甲基轉移酶；
[0018] (c)在步驟（c)中所產生的該去甲基DNA產物為去甲基化報道基因，其在該細胞內 表達報道蛋白；以及
[0019] (d)該分析步驟通過選自于由下列所組成的群組的技術以進行：
[0020] (i)分析在該細胞中由該去甲基化報道基因所編碼的報道蛋白的信號；
[0021] (ii)以蛋白質印跡法（Western blot)分析該報道蛋白的表達；以及
[0022] (iii)分離該甲基化與去甲基化報道基因并通過限制酶切-聚合酶連鎖反應 (PCR)分析、水解-薄層色層分析、以抗體為基礎的分析、閃爍計數、放射攝影術、斑點印跡、 以液相層析為基礎的分析以及以亞硫酸氫鈉為基礎的分析以分析去甲基反應的程度。
[0023] 于本發明的一個具體實施例中，該甲基化報道基因與該DNA甲基轉移酶是經由轉 染作用存在于該細胞內。或可選擇地，該DNA甲基轉移酶為存在于該細胞內的內生的酶。
[0024] 該甲基化報道基因轉染該細胞，且該DNA甲基轉移酶可為轉染至該相同細胞內的 外源的酶或已經存在于該相同細胞內的內生的酶。于一個具體實施例中，該甲基化報道基 因與該DNA甲基轉移酶共轉染至該細胞內。
[0025] 于本發明的一個具體實施例中，該測試藥劑被導入該細胞內或加入浸泡該細胞的 培養基中。
[0026] 于本發明的另一個具體實施例中，該甲基化報道基因包含選自于由熒光蛋白編碼 基因、熒光素酶基因、抗藥基因以及細胞存活的基因所組成的群組的基因的DNA序列。
[0027] 于本發明的另一個具體實施例中，該甲基化DNA包含5-甲基胞嘧啶 (5_methylcytosine，5mC)的 DNA。
[0028] 于本發明的另一個具體實施例中，步驟（C)是于無還原劑的環境下或于非還原的 環境下進行。
[0029] 該DNA甲基轉移酶可為野生型DNA甲基轉移酶的修飾形式，所述修飾形式保留該 野生型DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性。
[0030] 該DNA甲基轉移酶可選自于由DNA甲基轉移酶I、DNA甲基轉移酶3A、DNA甲基轉 移酶3B及其任何組合所組成的群組。
[0031] 該組成型啟動子可為，但不限于，巨細胞病毒（cytomegalovirus)啟動子。
[0032] 于另一方面，本發明關于一種將測試藥劑鑒定為DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲 基活性的調節物的方法，其中該方法包括：
[0033] (I)
[0034] a)在測試藥劑存在或不存在下，將含有甲基化DNA的第一組合物與含有該DNA甲 基轉移酶的第二組合物混合；
[0035] b)經由將該甲基化DNA與該DNA甲基轉移酶反應一段足夠的時間而使去甲基反應 發生，以產生去甲基化DNA產物；
[0036] c)分析去甲基反應的程度；以及
[0037] d)比較在該測試藥劑存在與不存在下該去甲基反應的程度，從而由此鑒定該用于 調節該DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的測試藥劑；
[0038] 其中當去甲基反應的程度在該測試藥劑存在下較低時，該測試藥劑被鑒定為該 DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的抑制劑；或當去甲基反應的程度在該測試藥劑存 在下較高時，該測試藥劑被鑒定為該DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的刺激劑；
[0039] 或者（II)
[0040] 1)提供含有經甲基化且可操作地連接于組成型啟動子的報道基因轉染的細胞的 細胞培養基，該細胞含有內生的DNA甲基轉移酶或外源地表達野生型、修飾的或基因工程 改造的DNA甲基轉移酶；
[0041] 2)將該細胞暴露于測試藥劑；
[0042] 3)使去甲基反應發生，以產生去甲基報道基因，其在該細胞內表達報道蛋白；以 及
[0043] 4)通過檢測在該細胞中該去甲基報道基因表達的該報道蛋白的信號強度，以分析 該報道基因的去甲基反應的程度；
[0044] 5)比較在該測試藥劑存在與不存在下，該報道基因的去甲基反應的程度，從而由 此將該測試藥劑鑒定該作為該DNA甲基轉移酶的DNA去甲基活性的調節物；
[0045] 其中當去甲基反應的程度在該測試藥劑存在下較低時，該測試藥劑被鑒定為該 DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的抑制劑；或當去甲基反應的程度在該測試藥劑存 在下較高時，該測試藥劑被鑒定為該DNA甲基轉移酶的活化DNA去甲基活性的刺激劑。
[0046] 該野生型DNA甲基轉移酶可選自于由DNA甲基轉移酶UDNA甲基轉移酶3A，以及 DNA甲基轉移酶3B所組成的群組。
[0047] 【附圖說明】本發明的一個或多個具體實施例，且與文字說明一起，用于解釋本發明 的原理。只要有可能，相同的組件符號是用于整個附圖中，以指具體實施例的相同或類似的 組件。 【附圖說明】
[0048] 圖1顯示該哺乳類DNMTs的DNA 5-mC去甲基活性。該含有5-mC的DNA底物在 含有IOmM CaClJ^緩沖液B中的293T核萃取物中進行反應，各核萃取物各自含有：外源 表達的EGFP(第1道與第2道）、小鼠 DNMTl (第3道與第4道）、DNMT3A(第5道與第6 道）、DNMT3B (第7道與第8道）、及其定點突變（第9-14道）。5-mC轉換為C的程度是以 水解-TLC分析法進行分析，且其定量顯示于該直方圖中。在第4、6、8道中該外源野生型酶 的量分別相似于在第1〇、12、14道中該突變酶的量（未顯示蛋白質印跡數據）。M代表未反 應的模擬對照組；R代表有進行反應者。誤差條顯示為S.D.。*代表p〈0. 05,是以t-檢驗 (t-test)將第4、6、8條與第2條比較。
[0049] 圖2A顯示重組DNMTs的DNA 5-mC去甲基活性的鈣依賴性。以重組DNMT3B將5-mC 轉換為C的水解TLC分析。該重組小鼠 DNMT3B的DNA去甲基活性的分析是通過將含有40nM 5-mC 的 DNA 底物與 40nM 的酶在含有 100 μ g/ml BSA 與遞增濃度（0、10 μ M、100 μ M、ImM、5mM 及IOmM)的CaCl；^緩沖液B中進行反應。所有反應均在37°C下進行4小時。量化結果呈 現于直方圖中。M代表未反應的模擬對照