重組細(xì)胞以及異戊二烯的生產(chǎn)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及能夠由一氧化碳等特定的Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯的重組細(xì)胞、以及 利用該重組細(xì)胞的異戊二烯的生產(chǎn)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 異戊二烯是合成聚異戊二烯的單體原料，尤其是在輪胎行業(yè)中為重要的原材料。 近年來(lái)，由依賴于石油的基礎(chǔ)化學(xué)品的生產(chǎn)工藝向來(lái)自植物資源等可再生資源的生產(chǎn)工藝 的轉(zhuǎn)換技術(shù)的開(kāi)發(fā)與實(shí)用化正在穩(wěn)步地進(jìn)行。關(guān)于異戊二烯，例如已知以糖為原料的利用 重組大腸桿菌的生產(chǎn)技術(shù)（專利文獻(xiàn)1、2)。
[0003] 關(guān)于來(lái)自可再生資源的生產(chǎn)工藝，包括上述異戊二烯生產(chǎn)技術(shù)在內(nèi)，其現(xiàn)有技術(shù) 基本上是依賴于有機(jī)物、特別是糖、甘油或油成分等的利用微生物的生產(chǎn)法。但是，為了維 持來(lái)自石油的多種基礎(chǔ)化學(xué)品的世界性生產(chǎn)量，在來(lái)自植物資源等的目前可使用的糖類、 甘油或油成分的量中，作為微生物的碳源不足是必須的。即，依賴于糖類或油成分的利用微 生物的基礎(chǔ)化學(xué)品生產(chǎn)量今后也是有限的。而且，這種工藝還有可能與食物競(jìng)爭(zhēng)。
[0004] 合成氣（Synthesis gas, Syngas)是在高溫·高壓下通過(guò)金屬催化劑的作用由廢 棄物、天然氣和煤炭有效得到的、以一氧化碳、二氧化碳和氫為主要成分的混合氣體。在以 合成氣為起點(diǎn)的利用金屬催化劑的Cl化學(xué)的領(lǐng)域中，正在開(kāi)發(fā)可廉價(jià)且大量生產(chǎn)甲醇、甲 酸、甲醛等液態(tài)化學(xué)品的工藝。
[0005] 另外，一氧化碳、二氧化碳和氫包含于廢棄物來(lái)源的合成氣或工廠廢氣、天然氣、 或者煤炭來(lái)源的合成氣中，幾乎永久能夠利用。但是，現(xiàn)狀是極少有作為以合成氣為代表的 Cl碳源的、利用微生物的化學(xué)品生產(chǎn)例。目前正在進(jìn)行開(kāi)發(fā)的僅僅是由合成氣生產(chǎn)乙醇、 2,3_ 丁二醇等。尤其是，很少有關(guān)于基于重組體的合成氣同化性物質(zhì)的利用的報(bào)道。專利 文獻(xiàn)3中公開(kāi)了利用大腸桿菌重組體的異丙醇的生產(chǎn)技術(shù)。該技術(shù)中，將多個(gè)CO代謝酶基 因?qū)氪竽c桿菌以賦予合成氣同化能力，由合成氣生產(chǎn)異丙醇。但是，該技術(shù)并不生產(chǎn)異戊 二烯。
[0006] 現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)
[0007] 專利文獻(xiàn)
[0008] 專利文獻(xiàn)1 :日本特表2011-505841號(hào)公報(bào)
[0009] 專利文獻(xiàn)2 :日本特表2011-518564號(hào)公報(bào)
[0010] 專利文獻(xiàn)3 :日本特表2011-509691號(hào)公報(bào)
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 發(fā)明要解決的問(wèn)題
[0012] 鑒于上述現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的在于提供能夠由合成氣等生產(chǎn)異戊二烯的一系列技 術(shù)。
[0013] 用于解決問(wèn)題的方案
[0014] 用于解決上述課題的本發(fā)明的方式之一為一種重組細(xì)胞，其中，編碼異戊二烯合 成酶的核酸被導(dǎo)入具有基于非甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力的宿主細(xì)胞中，該 核酸在所述宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，所述重組細(xì)胞能夠由Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯，所述Cl化 合物為選自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種。
[0015] 本發(fā)明還涉及一種能夠生產(chǎn)異戊二烯的重組細(xì)胞。本發(fā)明的重組細(xì)胞將編碼異戊 二烯合成酶的核酸導(dǎo)入具有"基于非甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力"的宿主細(xì) 胞中而成，并且該核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。而且，能夠由選自由一氧化碳、二氧化碳、甲 酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。根據(jù)本發(fā)明的重組細(xì)胞，可以由 所述Cl化合物合成異戊烯基二磷酸（IPP)，進(jìn)而將所合成的IPP轉(zhuǎn)換為異戊二烯。其結(jié)果， 可以由所述Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。通過(guò)利用本發(fā)明的重組細(xì)胞，例如可以由包含一氧化 碳或二氧化碳的合成氣生產(chǎn)異戊二烯。
[0016] 類異戊二烯的生物合成途徑大致分為甲羥戊酸途徑（也稱為MVA途徑）和非甲羥 戊酸途徑（也稱為MEP途徑）。非甲羥戊酸途徑是由甘油醛-3-磷酸和丙酮酸最終生成異 戊烯基二磷酸（IPP)或二甲基烯丙基二磷酸（DMPP)的途徑。本發(fā)明中使用的宿主細(xì)胞具 有基于非甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力。
[0017] 本發(fā)明的另一方式為一種重組細(xì)胞，其中，編碼異戊二烯合成酶的核酸被導(dǎo)入具 有由甲基四氫葉酸、一氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能的宿主細(xì)胞，該核酸在所述宿主細(xì) 胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，所述重組細(xì)胞能夠由Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯，該Cl化合物為選自由一氧化 碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種。
[0018] 本發(fā)明的重組細(xì)胞將編碼異戊二烯合成酶的核酸導(dǎo)入具有"由甲基四氫葉酸、一 氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能"的宿主細(xì)胞而成，并且該核酸在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。 而且，能夠由選自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl化合物生 產(chǎn)異戊二烯。也可以利用本發(fā)明的重組細(xì)胞由所述Cl化合物合成IPP，進(jìn)而將所合成的IPP 轉(zhuǎn)換為異戊二烯。其結(jié)果，可以由所述Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。通過(guò)利用本發(fā)明的重組細(xì) 胞，例如可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成氣生產(chǎn)異戊二烯。
[0019] 作為具有"由甲基四氫葉酸、一氧化碳和CoA合成乙酰CoA的功能"的細(xì)胞，可 例示出具有圖1所示的乙酰CoA途徑（Wood-Ljungdahl pathway)和甲醇途徑（Methanol pathway)的厭氧性微生物。
[0020] 優(yōu)選具有一氧化碳脫氫酶。
[0021] -氧化碳脫氫酶（EC 1. 2. 99. 2/1. 2. 7. 4)( -氧化碳脫氫酶、CO dehydrogenase、 CODH)具有由一氧化碳和水生成二氧化碳和質(zhì)子的作用、以及作為其逆反應(yīng)的由二氧化碳 和質(zhì)子生成一氧化碳和水的作用。一氧化碳脫氫酶是利用乙酰CoA途徑（圖1)發(fā)生作用 的酶之一。
[0022] 優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為梭菌（Clostridium)屬細(xì)菌或穆?tīng)柺暇∕oorella)屬細(xì)菌。
[0023] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入了編碼通過(guò)甲羥戊酸途徑發(fā)生作用的酶組的核酸，進(jìn)一步具有基 于甲羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸合成能力。
[0024] 通過(guò)該構(gòu)成，由甲羥戊酸途徑和非甲羥戊酸途徑兩者合成成為異戊二烯合成酶的 底物的IPP，可有效地進(jìn)行IPP的供給。其結(jié)果，本發(fā)明的重組細(xì)胞的異戊二烯生產(chǎn)能力進(jìn) 一步提尚。
[0025] 優(yōu)選所述甲羥戊酸途徑為酵母的甲羥戊酸途徑。
[0026] 優(yōu)選所述甲羥戊酸途徑為原核生物的甲羥戊酸途徑。
[0027] 優(yōu)選所述甲羥戊酸途徑為放線菌的甲羥戊酸途徑。
[0028] 優(yōu)選進(jìn)一步導(dǎo)入了編碼通過(guò)非甲羥戊酸途徑發(fā)生作用的至少一種酶的核酸，該核 酸在宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)。
[0029] 通過(guò)該構(gòu)成，基于非甲羥戊酸途徑的IPP合成能力得到增強(qiáng)。其結(jié)果，本發(fā)明的重 組細(xì)胞的異戊>條生廣能力進(jìn)一步提尚。
[0030] 優(yōu)選所述非甲羥戊酸途徑為宿主細(xì)胞以外的非甲羥戊酸途徑。
[0031 ] 優(yōu)選所述異戊二烯合成酶為植物來(lái)源。
[0032] 優(yōu)選編碼所述異戊二烯合成酶的核酸編碼下述（a)、（b)或（C)的蛋白質(zhì)。
[0033] (a)包含序列號(hào)2所表示的氨基酸序列的蛋白質(zhì)；
[0034] (b)包含序列號(hào)2所表示的氨基酸序列中1~20個(gè)氨基酸發(fā)生了缺失、置換或者 添加的氨基酸序列、且具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)；
[0035] (c)具有與序列號(hào)2所表示的氨基酸序列顯示出60%以上的同源性的氨基酸序 列、且具有異戊二烯合成酶的活性的蛋白質(zhì)。
[0036] 優(yōu)選導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的核酸的密碼子被改變。
[0037] 通過(guò)該構(gòu)成，可以在宿主細(xì)胞內(nèi)更有效地表達(dá)所導(dǎo)入的核酸（外來(lái)基因）。
[0038] 優(yōu)選導(dǎo)入至宿主細(xì)胞中的核酸被組入宿主細(xì)胞的基因組中。
[0039] 優(yōu)選導(dǎo)入至宿主細(xì)胞中的核酸被組入質(zhì)粒中。
[0040] 本發(fā)明的另一方式為一種異戊二烯的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法利用選自由一氧化 碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl化合物作為碳源，對(duì)上述重組細(xì)胞進(jìn) 行培養(yǎng)，使該重組細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯。
[0041] 本發(fā)明涉及異戊二烯的生產(chǎn)方法。本發(fā)明中，將選自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸 和甲醇組成的組中的至少一種Cl化合物作為碳源，對(duì)上述重組細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，由此使該重 組細(xì)胞生產(chǎn)異戊二烯。根據(jù)本發(fā)明，可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成氣、或者甲酸、 甲醇生產(chǎn)異戊二烯。
[0042] 本發(fā)明的另一方式為一種異戊二烯的生產(chǎn)方法，該生產(chǎn)方法使選自由一氧化碳、 二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl化合物與上述重組細(xì)胞接觸，在該重組細(xì) 胞中由所述Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0043] 本發(fā)明中，使選自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl 化合物與上述重組細(xì)胞接觸，由該Cl化合物生產(chǎn)異戊二烯。根據(jù)本發(fā)明，也可以由包含一 氧化碳或二氧化碳的合成氣、或者甲酸、甲醇生產(chǎn)異戊二烯。
[0044] 優(yōu)選將以一氧化碳和氫氣為主要成分的氣體、或者以二氧化碳和氫為主要成分的 氣體提供至所述重組細(xì)胞。
[0045] "將氣體提供至重組細(xì)胞"是指，以碳源等的形式將氣體提供至重組細(xì)胞、或者使 氣體與重組細(xì)胞接觸。
[0046] 優(yōu)選重組細(xì)胞以梭菌（Clostridium)屬細(xì)菌或穆?tīng)柺暇∕oorella)屬細(xì)菌作為 宿主細(xì)胞，并回收被釋放到重組細(xì)胞的細(xì)胞外的異戊二烯。
[0047] 也可以利用碳酸氫鹽代替二氧化碳。
[0048] 發(fā)明的效果
[0049] 利用本發(fā)明的重組細(xì)胞，可以由一氧化碳、二氧化碳、甲酸或甲醇生產(chǎn)異戊二烯。 例如，可以由包含一氧化碳或二氧化碳的合成氣生產(chǎn)異戊二烯。
[0050] 關(guān)于本發(fā)明的異戊二烯的生產(chǎn)方法也同樣，可以由一氧化碳、二氧化碳、甲酸或甲 醇生產(chǎn)異戊二烯。
【附圖說(shuō)明】
[0051] 圖1是表示乙酰CoA途徑和甲醇途徑的說(shuō)明圖。
[0052] 圖2是異戊二烯標(biāo)準(zhǔn)物品的氣相色譜。
[0053] 圖3是保持對(duì)照載體pSCiOl質(zhì)粒的永達(dá)爾梭菌（C. Ijungdahlii)的合成氣發(fā)酵 氣相成分的氣相色譜。
[0054] 圖4是保持pSCi : : idi-ispS質(zhì)粒的永達(dá)爾梭菌（C. Ijungdahlii)的合成氣發(fā)酵 氣相成分的氣相色譜。
[0055] 圖5是表示質(zhì)粒pSCi: :MVA-IspS_idi的異戊二稀合成基因簇的構(gòu)成的說(shuō)明圖。
[0056] 圖6是保持質(zhì)粒pSCi : :MVA-IspS_idi的永達(dá)爾梭菌（C. Ijungdahlii)的合成氣 發(fā)酵氣相成分的氣相色譜。
【具體實(shí)施方式】
[0057] 本發(fā)明的方式之一的重組細(xì)胞將編碼異戊二烯合成酶的核酸導(dǎo)入具有基于非甲 羥戊酸途徑的異戊烯基二磷酸（IPP)合成能力的宿主細(xì)胞中而成，該核酸在所述宿主細(xì)胞 內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，能夠由選自由一氧化碳、二氧化碳、甲酸和甲醇組成的組中的至少一種Cl化 合物生產(chǎn)異戊二烯。
[0058] 本方式的重組細(xì)胞中的宿主細(xì)胞具有"基于非甲羥戊酸途徑的IPP合成能力"。
[0059] 如上所述，通常IPP的合成途徑大致分為甲羥戊酸途徑（MVA途徑）和非甲羥戊酸 途徑（MEP途徑）這兩種。甲羥戊酸途徑是真核生物所具備的，將乙酰CoA作為起始物質(zhì)。作 為通過(guò)甲羥戊酸途徑發(fā)生作用的酶，從上游起依次可以舉出乙酰CoA乙酰