一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒及其檢測方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于病毒檢測領域，涉及一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的 試劑盒及其檢測方法。
【背景技術】
[0002] 艾滋病即獲得性免疫缺陷綜合征（acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)，是一種慢性致死性傳染病，由人類免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus, HIV)引起，分為人類免疫缺陷病毒1型（HIV-I)和人類免疫缺陷病毒2型（HIV-2)，HIV-I 是目前全球包括中國在內流行的主要毒株，HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后導致 人體免疫機能缺陷，從而發生機會性感染和腫瘤等一系列臨床綜合征，病死率幾乎達100%。 艾滋病至今尚無確切有效的治療藥物，HIV感染的早期發現、早期診斷是防止艾滋病流行 的重要手段，也是艾滋病預防控制工作的重要組成部分。
[0003] 實驗室檢測是診斷HIV感染的主要依據，根據檢測水平的不同，可分為蛋白水平、 細胞水平和基因水平的檢測。主要包括抗體和抗原檢測、病毒分離和病毒核酸檢測等。提 高HIV檢測的敏感性，縮短窗口期是HIV早期診斷的主要研宄目的。
[0004] 蛋白水平檢測主要包括HIV抗原檢測及其機體針對抗原產生的特異性抗體，是 HIV感染診斷中最常用方法，可分為初篩實驗和確認實驗，分別以ELISA和Western blot方 法為代表，主要有"窗口期"長（14天至2個月）及容易受干擾物影響出現假陽性等缺點。
[0005] 細胞水平檢測主要以細胞分離培養和CD4+淋巴細胞計數為主，前者能夠直接檢 測病毒，專一性很強，有高度的特異性，不會出現假陽性，且可以獲得樣品中原始病毒株，可 進一步進行耐藥性和生物學特性研宄。但是其敏感性較低，周期長，費用高，需要在P3實驗 室進行，易造成實驗室感染，故臨床應用較少。后者作為直接測定免疫功能的方法，可以用 于檢測HIV感染進展狀況、判斷預后，了解機體免疫狀態進行疾病分期，監測抗病毒治療效 果等，但由于昂貴儀器及大量標本要求，無法對HIV早期感染進行檢測，從而極少在HIV篩 查中應用。
[0006] 病毒核酸檢測，目前以病毒載量（RNA)檢測為主，利用分子生物學技術檢測HIV 病毒核酸，不僅可以定性地檢測樣本中是否含有HIV病原體，輔助早期診斷HIV感染，縮 短窗口期；還可以對樣本中病毒進行定量，即檢測病毒載量，用于病程監控、指導治療方案 及療效判定和預測疾病進展等。目前國內外已上市的病毒載量檢測試劑盒檢出限在20~200 拷貝/mL之間，低于500拷貝/mL定量不穩定，另外標本收集及保存要求較高，RNA容易降 解，而且不同實驗室和不同方法間病毒載量測定值變異很大，病毒載量絕對值不能直接比 較。HIV在感染細胞時通過逆轉錄作用形成大量前病毒DNA，部分整合到細胞基因組中，穩 定不易降解。因此近年來，研宄人員開發HIV前病毒DNA檢測方法來替代病毒載量檢測，據 文章報道的HIV-I DNA最低檢出限在10拷貝/百萬細胞以上。
[0007] 此外，目前HIV檢測方法所用的標本主要來自HIV感染者或病人的血漿或全血。但 是這種些樣本在采集、分離、保存和運輸過程中不可避免地會遇到一些難題，如一些實驗室 條件欠完善地區并不能及時地將采集的全血分離、凍存。此外，受生物危險品運輸限制，全 血或血漿需專人冷鏈運輸。為了解決上述問題，醫護人員采用美國食品和藥品管理局（FDA) 批準的國際通用903#濾紙，制備成干血斑樣本，為篩查工作帶來很多便利，如：可常溫保存 運輸，常溫下可保存3個月以上，無病毒感染等。由于干血斑標本采樣量少（50~75 μ L全 血)，使其檢測靈敏度比血漿或全血標本檢測靈敏度低10倍左右，一定程度上影響干血斑在 HIV篩查應用。
【發明內容】
[0008] 為了解決上述問題，本發明通過開發一種簡單高效的干血斑提取試劑，以及宄篩 選出高靈敏和高特異性的引物序列和檢測探針，并設置特定的PCR反應程序和條件，構建 了高敏感干血斑標本中HIV-I DNA PCR檢測試劑盒及檢測方法。
[0009] 本發明的目的在于提供一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒。
[0010] 本發明的另一目的在于提供一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的方 法。
[0011] 本發明所采取的技術方案是： 一種檢測干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的試劑盒，包含有核酸提取液和PCR反 應液，所述的PCR反應液中含有PCR引物組和檢測探針； 所述引物組選自引物組1、引物組2和引物組3中的至少一組，其中： 引物組 1 由 SEQ ID N0:1、SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID Ν0:5 和 SEQ ID NO :6 組成； 引物組 2 由 SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO: 10 和 SEQ ID NO: 11 組成； 引物組 3 由 SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13 和 SEQ ID NO: 14 組成； 所述探針情況如下： 當試劑盒中含有引物組1時，該試劑盒至少含有探針SEQ ID NO: 15或其核苷酸互補序 列； 當試劑盒中含有引物組2時，該試劑盒中含有探針SEQ ID NO: 16、SEQ ID NO: 17、SEQ ID NO: 18或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針； 當試劑盒中含有引物組3時，該試劑盒含有探針SEQ ID N0:19、SEQ ID N0:20、SEQ ID N0:21、SEQ ID N0:22或者該些序列的核苷酸互補序列中的至少一條探針。
[0012] 進一步的，上述核酸提取液含有：10~50mM Tris-HCl (pH8. 0)、30~50mM KC1、 5~10%0^16叉100、0.5~1%1'1^〇11父-100、0.5~1%咿-40和10~5〇1111辛酸納。
[0013] 進一步的，上述探針序列5'端標記的熒光基團為FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一種， 探針序列3'端標記的淬滅基團為TAMRA、MGB、BHQ中一種。
[0014] 進一步的，上試劑盒還包含細胞定量引物組和細胞定量探針； 所述細胞定量引物組由 SEQ ID NO: 23、SEQ ID NO: 24、SEQ ID NO: 25和 SEQ ID NO: 26 組成； 所述探針為含SEQ ID NO:27或者為其核苷酸互補序列； 細胞定量探針序列所標記的熒光基團可從FAM、HEX、VIC、CY5、TET選擇，但不同于權利 要求3所述探針的熒光基團。
[0015] 進一步的，上試劑盒還含有：陰性對照、陽性定量參考品和含有酶與UNG酶的 酶系。
[0016] 進一步的，上述的陽性定量參考品為8E5或Ach2細胞株基因組，用于同時對HIV-I DNA及細胞數定量。
[0017] 一種干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型的檢測方法，包括以下步驟： 1) 干血斑核酸提取： 用打孔器將干血斑打孔，將打孔的樣品置于離心管中；加入滅菌水，劇烈震蕩3~5秒， 室溫放置30分鐘后震蕩3~5秒；12000rpm離心I. 5~2. 5分鐘，去上清液，留足夠上清液蓋沒 沉淀；加入核酸提取液100 μ L，震蕩3~5秒，放置于56°C震蕩孵育25~30分鐘；于95~100°C 孵育5~10分鐘；12000rpm離心3~5分鐘，轉移上清到新離心管中作為DNA模板； 2) PCR反應體系： PCR 反應液 29. 2 μ L ; 酶系 0.8yL; DNA 模板 20 μ L ; 3) PCR反應程序： 以ΑΒΙ7500為例，第一步：37°C 5分鐘；第二步：95 °C 10分鐘；第三步：95 °C 15 秒，62~68 °C 15 秒，72°C 20 秒，5~8 個循環；第四步：95 °C 15 秒，62~65 °C 15 秒，72°C 20秒，5~8個循環；第五步：95°C 15秒，60°C 1分鐘，40個循環；60 °C時采集 熒光； 4) 結果分析： 反應結束后自動保存結果，對HIV-I DNA的擴增曲線和相應細胞擴增的曲線進行分別 分析；點擊Analyze進行分析，使Std Curve窗口下的標準曲線圖達到最佳，即Correlation 數值介于-1. 〇〇. 98,然后到Plate窗口下記錄定量結果； 細胞中HIV-I DNA含量結果計算： 同一份標本中，用2條標準曲線定量的HIV-I DNA定量值除以細胞定量值，得出標本中 每個細胞中HIV-I DNA含量。
[0018] 進一步的，在上述整個檢測過程中，需保證各樣品滿足以下質量要求： ① 陰性對照：HIV DNA擴增曲線無 CT值顯示； ② 陽性定量參考品的結果均為陽性，Ct值<30,且2條標準曲線線性相關系數0.98 ^ r ^ 1 ； 以上要求需要在同一次實驗中同時滿足，否則，本次實驗無效，需重新進行。
[0019] 本發明的有益效果是： 1) 本發明的干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型PCR檢測試劑盒靈敏度可達到血漿或 全血標本檢測靈敏度，但更方便標本收集、存儲、運輸； 2) 本發明技術開發干血斑標本中人類免疫缺陷病毒1型PCR檢測試劑盒及其檢測方法 的檢測方法可以同時對HIV-I D