一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及動物疾病檢測診斷方法技術領域，特別是涉及一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，非常適合在現場對水貂阿留申病毒進行定性及定量檢測，對于飼養場早期檢測診斷、流行病學疫情調查及進出口岸檢測具有重要作用。
【背景技術】
[0002]自20世紀50年代發現水貂阿留申病(ADM)以來，由于ADM致病機理比較特殊，所以至今尚未研制出有效預防該病的常規疫苗，生產上主要以預防為主，目前主要通過檢測阿留申病毒(AMDV)發現陽性者淘汰凈群控制ADM。所以建立一種有效的診斷方法對ADM的防治有重要意義，傳統的AMDV檢測方法包括:病原的分離和生物學實驗、電鏡技術等病原學診斷方法，碘凝集試驗(IAT)和對流免疫電泳(CIEP)、補體結合試驗、免疫復合物檢測法(CIC)等血清學檢測方法；基因芯片技術、聚合酶鏈式反應(PCR)、核酸雜交技術等分子生物學診斷方法。這些方法普遍存在如周期長、操作繁瑣、特異性、敏感性和重復性差等缺點，不適合大批量自動化檢測，給ADM的防控帶來一定困難。
[0003]熒光定量PCR由于采用了完全閉管檢測，不需凝膠電泳等PCR后處理，避免了交叉污染，整個檢測過程可實現自動化，且反應快速、重復性好、靈敏度高、特異性強、結果清晰、勞動強度小，易于批量化、標準化應用。隨著熒光定量PCR儀和相應耗材價格的降低，尤其是小型實時熒光定量PCR和配套自動化操作設備的出現，極大地降低了熒光定量PCR的成本，簡化了定量檢測的過程，提高了工作效率。可以預見不久將來，隨著熒光定量PCR相關成本進一步下降和可攜帶全自動熒光定量PCR儀出現，采用該技術對AMDV進行現場檢測將成為控制ADM的一種有效方法。
【發明內容】
[0004]本發明的目的在于提供一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，用于對AMDV的檢測。
[0005]為了實現快速檢測AMDV，本發明是通過以下技術方案實現的:
一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該引物包括上游引物和下游引物，上游引物序列為SEQ ID N0.1 5’- CCCTCCAGGTCAACTCTTTGTTAAA-3’和下游引物序列為SEQ ID N0.2 5’-GCCTCTCCAAGTAAAGTAACCATAGG-3’。
[0006]一種快速檢測水貂阿留申病毒的引物、試劑盒及方法，該試劑盒包括I)含有上述的上游引物和下游引物以及SYBR Green染料的PCR Master mix，上、下游引物終濃度均為0.25 μ mol/L ；2)病毒裂解液；3)陰性對照_無菌超純水；4)陽性對照_ 12Copies/ μ L連有病毒部分序列amdv-fl的似19-T_amdv-fI質粒，amdv-fI序列如SEQ ID N0.3所不；5)異丙醇；6)75%乙醇。
[0007]/7細19-T-amdv-f I陽性質粒制備方法如下:利用上游引物SEQ ID N0.1和下游引物SEQ ID N0.2以水貂AMDV-G株為模板，在EasyCycler基因擴增儀(Analytikjena)進行。反應體系為 20 yL，包括:10yLPremixTaq，8yLddH20，1“14莫板，上下游引物(各5 4!1101/L)混合物I μ L0擴增參數為:94°C預變性1s ;94°C變性30s，55。。退火30s，72。。延伸30s，共30個循環；72°C后延伸7 min。
[0008]反應產物利用2%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠回收試劑盒對PCR產物純化回收，將回收的PCR產物用pMD19-T Vector進行連接，在0.2 mL的PCR管中，取PCR回收產物4 μ?和pMD19-TVector ?μ?，加5μ?連接緩沖液，16°C過夜連接。連接液全量(10 μ L)加入至100 4 1^水中溶解1^&1185 0感受態細胞中，冰中放置30 min。42°C加熱45 S后，再在冰中放置lmin。加入89(^1^0(:培養基，371:振蕩培養601^11。在含有X_Gal、IPTG、Amp的L-瓊脂平板培養基上培養，形成單菌落。挑選白色菌落，使用PCR法確認載體中插入片段的長度大小。從平板上挑取4個克隆接種于5 mL 100 μ g/mL氨芐的LB培養基中，37 °C培養14h。取4mL過夜培養菌液，用質粒提取試劑盒抽提質粒，送質粒測序。將測序結果正確的質粒命名為似19-T-amdv-fl并在B1Photometer (eppendorf )上測定濃度,根據重組質粒提取物濃度計算拷貝數。
[0009]制備I X 101° copies/ μ L的溶液作為標準品原液，_80°C保存。將標準品原液10倍梯度稀釋成101(l-10°COpies/ μ L標準品在熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR檢測，以ddH20為模板為陰性對照，以閾值循環數(Ct)彡30出現標準“S”型擴增曲線的最低濃度梯度作為檢測的靈敏度。反應體系如下:2XPCRmix (Power SYBR Green PCR Master Mix,Applied B1systems) 10 μι,模板 I μ L,上下游引物混合物(5 μ mol/L) I μ L, ddH20 8 μ L0擴增程序如下:95 °C預變性10 min ；95 °C變性15 s、60 °C退火60 s，40個循環。本方法結果顯示該方法的敏感性達到10 copies/ μ L, 12Copies/ μ L及以上時具有良好的特異性和重復性，在陰性對照無擴增，表明該方法特異性良好。
[0010]將標準品原液10 倍梯度稀釋取 109、108、107、106、105、104、103、102 copies/μ L 作為標準品，在熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR檢測，每個樣品3次重復，反應條件如上，根據Ct值以及模板起始拷貝數制作標準曲線和標準方程。從擴增曲線(圖1)可以看出:總體看所有曲線拐點清楚，指數期明顯，擴增曲線整體平行性好，基線平無上揚現象，低濃度樣本擴增曲線指數期明顯；從圖2熔解曲線可以看出，模板梯度熔解曲線僅有I個明顯峰，說明引物設計合理沒有產生非特異性擴增和二聚體。本方法建立AMDV實時熒光PCR定量標準曲線(圖3)方程:Y = -3.082Χ +36.762，r 2= 0.995，其中Y代表Ct值，X代表模板量的對數值。其線性范圍可達8個數量級。
[0011]快速檢測水貂阿留申病毒試劑盒生產組裝及應用:快速檢測水貂阿留申病毒試劑盒的規格為96個反應/盒。因此根據檢測數量對試劑的各組分進行制備和分裝。
[0012]試劑盒生產組裝:
(I)對照品及水
陽性對照:IXlO2 copies/ μ L的/7細19-T-amdv質粒分裝為25 μ L/管，_20°C保存。
[0013]陰性對照和溶解DNA用水:超純水高壓滅菌后，分裝為2.5mL/管，_20°C保存。
[0014](2)試劑
病毒裂解液:配制含3mol/L異硫氰酸胍、0.4%十二燒基肌氨酸鈉、0.12 mmol/L β -巰基乙醇、20mmol/L檸檬酸鈉的病毒裂解液，40mL/瓶分裝，_4°C保存。
[0015]異丙醇:60 mL/瓶分裝，常溫保存。
[0016]75%乙醇:超純水高壓滅菌后配制75%乙醇，120mL/瓶分裝，常溫保存。
[0017]PCR Master mix:取商品化 2 X SYBR Green PCR Master mix、無菌超純水、5 μ mol/L上下游引物混合物按10:7:1比例混合，18 μ L/管分裝于8連管或96孔板中，_20°C避光保存。
[0018](3)試劑盒組裝
陽性對照、陰性對照和溶解DNA用水各I管，病毒裂解液、異丙醇、75%乙醇各I瓶，1.5mL離心管96個，含18 μ L/管PCR Master mix 8聯PCR反應管12組或含18 μ L/管PCRMaster mix 96 孔板 I 塊。
[0019]本發明還提供了一種采用上述的試劑盒檢測水貂阿留申病毒方法，包括以下步驟:
(I)待檢樣本的DNA提取；每個1.5mL塑料離心管中加入200 μ L待測液體樣本(血清、組織液、尿液等)。加入400 μ L病毒裂解液，振蕩40s后室溫放置lOmin。振蕩30s混勻后加入600 μ L異丙醇，振蕩45s混勻后，15000g室溫離心16min。移棄上清，加入1.2mL75%乙醇，振蕩15秒后15000g室溫離心5min，棄上清，離心15s棄殘留殘留，開蓋靜置30s，加20 μ L超純水,振蕩溶解待用。
[0020](2)熒光PCR檢測；取上述溶液2 μ L同時各取陰陽性對照2 μ L加入含18 μ L/管PCR Master mix 8聯PCR反應管或含18 μ L/管PCR Master mix 96孔板中混勻后在熒光定量PCR儀上進行擴增擴增程序如下:95 °C預變性10 min ；95 °C變性15 s、60 °C退火60 s，40個循環。
[0021](3)結果判定:反應液測定Ct值均大于35或無數值的標本為陰性；Ct ( 30的標本為陽性標本；測定30〈 Ct〈 35的標本需復測，復測結果Ct < 35為陽性，復測結果C