的雙重pcr方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于分子標記輔助育種技術領域，特別是涉及一種同時檢測番茄抗病基因 Ty-3a和Tm-2a的雙重PCR方法。
【背景技術】
[0002] 番前（Lycopersicon esculentum)是一種世界性蔬菜，營養豐富，適應性廣、產量 高，深受消費者的喜愛。番茄黃化曲葉病毒病（TYLCVD)和番茄煙草花葉病毒病（ToMVD)是 番茄生產上的重要病害，分布廣，危害重。選育抗番茄黃化曲葉病毒病和煙草花葉病毒病等 病害的多抗性品種，是國內外番茄研宄的重要內容。
[0003] 隨著分子生物學技術的發展，利用分子標記輔助選擇技術（MAS)選擇抗病材料已 越來越多的應用于番茄育種中。分子標記輔助選擇與傳統人工接種鑒定相比，具有效率高、 速度快、結果準確等優點，因此建立抗病基因的高效分子標記選擇體系，現代育種技術的一 項重要內容。
[0004] Ty_3a是番前黃化曲葉病毒病的主效抗病基因，Tm_2a是煙草花葉病毒病的主效抗 病基因，目前，這兩個抗病基因已分別建立自己的分子標記輔助選擇體系，但尚未建立兩個 抗病基因同時檢測的分子標記輔助檢測體系。建立雙重PCR檢測體系，可以節省人力、物 力、節約時間，提高材料的鑒定和選擇效率。
【發明內容】
[0005] 針對上述存在的技術問題，本發明提供一種同時檢測番茄抗病基因 Ty-3a和Tm-2a 的雙重PCR方法。該方法通過引物設計、基因組DNA的提取、雙重PCR反應體系的建立、反 應產物的凝膠成像檢測等步驟，實現利用同一個分子標記選擇體系同時檢測Ty-3a和Tm-2 a 兩個抗病基因的方法，為番茄抗病材料的選擇和抗病育種奠定基礎。
[0006] 本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：
[0007] 本發明一種同時檢測番茄抗病基因 Ty_3a和Tm_2a的雙重PCR方法，該方法通過 引物設計、基因組DNA的提取、雙重PCR反應體系的建立、反應產物的凝膠成像檢測步驟，確 定番茄育種試材對這兩個抗病基因的抗性情況，以選擇抗病材料和選育抗病品種，具體兩 個抗病基因的雙重PCR鑒定方法包括下列步驟：
[0008] (1)根據Ty_3a* Tm-2W個抗病基因分子標記的引物序列設計引物，引物序列如 下表：
[0009]
[0010] ⑵利用CTAB法提取基因組DNA ;
[0011] (3)將兩對引物放入同一 PCR反應體系中，進行PCR擴增；
[0012] (4)將PCR產物進行1. 5%瓊脂糖凝膠電泳，再用Bio-RAD凝膠系統成像；
[0013] (5)對擴增片段進行分析：擴增出650bp片段為含有抗病基因 Ty-3a的抗病純合 材料，擴增出650bp和320bp片段為含有抗病基因 Ty-3a的抗病雜合材料，擴增出320bp片 段為不含抗病基因 Ty-3a的純合感病材料，擴增出472bp片段為含有抗病基因 Tm-2a的抗 病材料。
[0014] 進一步地，所述雙重PCR反應總體系為25 μ L溶液體系，其組分和含量為：模板 DNA 2 μ L，兩對引物各 1.5 μ L, 10 X Buffer 2.5 μ L，Mgcl2 1.5 μ L，dNTP 0.4 μ L，Taq 酶 0. 4 μ L，補充超純水至25 μ L ;
[0015] 本發明所述PCR反應體系按照如下程序進行雙重PCR反應：94°C預變性5min ;然 后94°C變性30s，58. 5°C復性30s，72°C延伸I. 30min，進行30個循環；最后72°C延伸lOmin。
[0016] 本發明的有益效果為：
[0017] 1.本發明在一個PCR反應體系中同時檢測兩個抗病基因，所用時間只是分別檢測 兩個抗病基因的一半，提尚基因的檢測效率。
[0018] 2.本發明能夠節約抗病基因檢測所需要的藥品，降低了試驗成本。
【附圖說明】
[0019] 圖1為本發明實施例T y_3a基因引物擴增產物。
[0020] 圖2為本發明實施例Tm-2a基因引物擴增產物。
[0021] 圖3為本發明實施例Ty-3和Tm_2a基因的雙基因擴增產物。
[0022] 圖4為本發明實施例利用Ty_3a和Tm_2aS因的引物對19份番茄的雙重PCR結 果。
【具體實施方式】
[0023] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的詳細說明。
[0024] 實施例：本發明為一種同時檢測番茄抗病基因 Ty_3a和Tm_2a的雙重PCR方法，該 方法通過引物設計、基因組DNA的提取、雙重PCR反應體系的建立、反應產物的凝膠成像檢 測步驟，實現利用同一個分子標記體系同時檢測Ty-3a和Tm-2 a兩個抗病基因的方法，確定 番茄育種試材對這兩個抗病基因的抗性情況，以選擇抗病材料和選育抗病品種，具體兩個 抗病基因的雙重PCR鑒定方法包括下列步驟：
[0025] (1)根據Ty_3a* Tm_2W個抗病基因分子標記的引物序列設計引物，引物序列如 下表：
[0026]
[0027] (2)利用CTAB法提取基因組DNA ;
[0028] (3)將兩對引物放入同一 PCR (聚合酶鏈式反應）反應體系中，進行PCR擴增；
[0029] 所述雙重PCR反應總體系為25 μ L溶液體系，其組分和含量為：番茄模板DNA 2 μ L，兩對引物各1. 5 μ L，10 XBuffer (緩沖液，外購，主要成分是KCL和Tris-HCL) 2. 5 μ L， Mgcl2 L 5 μ L，dNTP (脫氧核糖核苷三磷酸）0· 4 μ L，Taq酶（DNA聚合酶）0· 4 μ L，補充超純 水至25 μ L ;
[0030] 所述PCR反應體系按照如下程序進行雙重PCR反應：94°C預變性5min ;然后94°C 變性3〇8,58.5°0復性3〇8,72°0延伸1.3〇11^11，進行30個循環；最后72°0延伸1〇1^11。
[0031] (4)將PCR產物進行1. 5 %瓊脂糖凝膠電泳（Goldview染色），再用Bio-RAD凝膠 系統成像；
[0032] (5)對擴增片段進行分析：擴增出650bp片段為含有抗病基因 Ty_3a的抗病純合 材料，擴增出650bp和320bp片段為含有抗病基因 Ty-3a的抗病雜合材料，擴增出320bp片 段為不含抗病基因 Ty-3a的純合感病材料，擴增出472bp片段為含有抗病基因 Tm-2a的抗 病材料。
[0033] 以下具體說明本發明的檢測過程：
[0034] 1.番茄材料：本例所用的番茄材料共29份，均為遼寧省農科院蔬菜所提供。其 中10份材料用于Ty-3a和1'111-2 3兩個抗病基因的單基因 PCR檢測和雙重PCR檢測，編號為 1-10 ;另19份材料為未知抗病性的番茄材料，用雙重PCR檢測方法檢測其抗病性。
[0035] 2.引物設計
[0036] 鑒定Ty_3a和Tm-2^t性基因所使用的引物序列如下表，引物由上海生物工程技 術公司合成。
[0037]
[0038] 3.番茄基因組DNA的提取
[0039] 采用改良CTAB法提取基因組DNA，具體步驟如下：
[0040] (1)取番茄頂端幼嫩葉片0. 5g于2mL離心管中，液氮冰凍，研磨至粉狀；
[0041] (2)立即加入65°C預熱的CTAB裂解液800 yL，混勾，65°C水浴Ih ;
[0042] (3)水浴結束后，向離心管中加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)，混勾，1000 Orpm 離心15min ;
[0043] (4)吸取上清液于另一 2mL離心管，向其內加入等體積的氯仿/異戊醇（24:1)，混 勻，1000 Orpm 離心 IOmin ;
[0044] (5)吸取上清于2mL離心管，向其內加入420 μ L異丙醇，60 μ L醋酸鈉，上下顛倒 混勻。置于-20°C 60min;
[0045] (6)取靜置結束的離心管離心，1000 Orpm離心10min，溫度為4度最好。
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