一種催化合成阿扎那韋中間體的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種羰基還原酶與輔酶共固定化體系催化合成阿扎那韋中間體 (3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的方法，屬于生物技術和生物制藥 領域。
【背景技術】
[0002] 目前，艾滋病治療藥物主要有三大種類，其中蛋白酶抑制劑（Pls)具有相當強的 抗HIV作用，是目前經常使用的藥物(約占26%)。抗HIV作用的蛋白酶抑制劑阿扎那韋 (Atazanavir)是目前世界上主要的抗艾滋病藥物。1998年，美國百時美施貴寶公司開發出 了阿扎那韋的商品藥一硫酸阿扎那韋，該藥物在2003年6月經美國FDA批準上市，這也是 全球首個每日一次給藥的蛋白酶抑制劑，其主要與其他抗逆轉錄病毒藥物聯用治療HIV病 毒，中國也于2007年4月批準其上市，商品名稱銳艾妥'
[0003] (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基-(2R) - 丁醇（I )是制備阿扎那韋的 關鍵中間體，可由氯醇（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2-丁酮（II)不對稱還 原獲得。還原法又可分為化學法和微生物法，化學法需要制備手性化學催化劑，制備工序繁 瑣且通常環境污染大。相對于化學法而言，酶催化轉化法具有"反應條件溫和、轉化率高、易 工業化放大"等優點，符合綠色可持續發展的要求。 ，?ι Γ"'? ? .文丄.1...丄 Λ ，· o it V α ， ο w cl H H I O 0Η I η
[0004] Codexis (W02011005527A2)及蘇州漢酶（CN103468757A)均直接將游離酶及游離 的輔酶應用在阿扎那韋中間體（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的 合成中，羰基還原酶及輔酶均不能重復利用，輔酶價格昂貴，成本較高。
[0005] 因此，通過生物法合成（3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基-(2R) - 丁醇 仍具有改進的空間。在已有的報道中，還未見有將羰基還原酶與輔酶共固定化用于制備阿 扎那韋中間體（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R)-丁醇的報道。
【發明內容】
[0006] 本發明所要解決的技術問題為現有生物法合成（3S)-3_(叔丁氧羰基）氨 基_1 _氯_4_苯基-(2R) - 丁醇成本過尚、效率過低，而提尚生物法合成（3S) _3_ (叔丁氧幾 基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇的效率、降低其生產的成本為本發明的目的。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發明的技術方案為： 以（3S)_3_(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮為底物，以羰基還原酶與輔 酶為催化劑，在緩沖液、助溶劑和共底物存在的體系中催化合成（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨 基-1-氯-4-苯基-2- 丁醇，并將羰基還原酶和輔酶共固定化于經過修飾后的磁性介孔材 料上。
[0008] 其中，對于修飾后的磁性介孔材料應理解為，該材料為共固定化酶的載體，而且該 材料通過改性，具有磁性的物性。
[0009] 在一個優選的實施方案中，以SBA-15、MCM-41、MCM-48之一為介孔材料，特別優選 SBA-15 ;再通過介孔材料表面的羥基與磁性材料形成配位鍵獲得磁性修飾的介孔材料；并 用3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)修飾帶有磁性的介孔材料使其表面帶有氨基，示意圖見 圖1。其中，介孔材料優選平均孔徑為2-50 nm，比表面積為500-1500 m2/g。
[0010] 在一個優選的實施方案中，修飾獲得帶有磁性的介孔材料的具體步驟為：（1)將 介孔材料加入到含有（NH 4)2Fe(SO4)2. 6H20、NH4Fe(SO4)2. 12H20的水溶液中，用氨水調節pH 至11~12,40-70°C攪拌，獲得含有磁性的介孔材料；（2)將步驟（1)中獲得的磁性介孔材料 加入至乙醇水溶液中，在氬氣保護下攪拌，加入冰醋酸至pH維持在3. 0-5. 0,向體系中加入 3_氨丙基三乙氧基硅烷（APTES)，50-80°C攪拌24-36 h，分離獲得固體，即得修飾后的磁性 介孔材料。
[0011] 在本發明所述的方法中，還包括了共底物和助溶劑，其中，共底物是指現有技術中 為了降低生產成本，設計的輔酶循環體系，助溶劑是為了提高底物的分散效果；在該體系中 共底物優選異丙醇，助溶劑優選甲苯。
[0012] 在本發明所述的方法中，所用催化劑為氧化還原酶與輔酶，其中，氧化還原酶為現 有氧化還原酶中的任一一種，只要其可以實現底物的非對稱氧化還原即可，如在本發明中 優選海洋新鞘氨醇桿菌羰基還原酶；輔酶為NAD/NADH或NADP/NADPH。
[0013] 在本發明中，共固定化的方法在于，將輔酶加入到含羰基還原酶的pH為6. 0-7. 0 的磷酸鹽緩沖液中，4°C靜置0.2-2 h ;然后加入修飾后的磁性介孔材料，100-150 rpm，25°C 溫浴2-8 h，得懸浮液；磁性吸附，去上清，磁性固體用生理鹽水洗滌，重復2-4次，得固體即 為羰基還原酶與輔酶共固定化酶體系；獲得的固定化酶體系可經過冷凍干燥后，4°C保存。
[0014] 在獲得催化劑以后，可將該催化劑在共底物、助溶劑、緩沖體系存在的情況下 與底物（3S)-3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮接觸，即可催化合成產物 (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氛基-1-氣_4_苯基_2_ 丁醇。
[0015] 在優選的方案中，底物初始濃度控制為50-200 mg/ml ;助溶劑用量為總反應體積 的5-20% ;共固定化酶、異丙醇、底物的投料質量比為0. 05-0. 1:0. 3-0. 5:1 ;輔酶與羰基還 原酶的質量比為1:5-20。
[0016] 在優選的實施步驟中，獲得羰基還原酶與輔酶共固定化酶體系后，將底物 (3S) -3-(叔丁氧羰基）氨基-1-氯-4-苯基-2- 丁酮、助溶劑、異丙醇、共固定化酶及三乙 醇胺緩沖液（pH 8. 0-8. 5)加入到反應器中，100-150 rpm攪拌，30-40°C保溫反應，HPLC 檢測，轉化率>99%，反應結束；并通過磁性吸附反應液中回收共固定化酶體系；并獲得產物 (3S) _3_ (叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基-(2R) - 丁醇。
[0017] 本發明的有益效果在于： 采用修飾后的磁性介孔材料共固定化羰基還原酶及輔酶催化合成（3S)-3-(叔丁氧羰 基）氨基-1-氯-4-苯基-(2R) - 丁醇，采用簡單的磁性吸附即可回收利用羰基還原酶及輔 酶，即簡化了產品的分離純化過程又使共固定化酶回收利用率高，更獲得了共固定化輔酶 再生體系，提高輔酶再生效率，降低了輔酶的用量，從而大幅度降低生產成本，具有廣闊的 應用前景。
【附圖說明】
[0018] 圖1為磁性修飾的介孔材料固定化酶的模擬流程圖； 圖2為實施例4中反應24 h后的HPLC譜圖； 圖3為實施例4中反應48 h后的HPLC譜圖； 圖4為實施例5中反應24 h后的HPLC譜圖； 圖5為實施例5中反應48 h后的HPLC譜圖； 圖6為（3S) _3_(叔丁氧幾基）氨基-1-氯_4_苯基_2_ 丁酮、（3S) _3_(叔丁氧幾基） 氨基-1-氯-4-苯基-(2R)- 丁醇及甲苯的標準品的HPLC譜圖。
【具體實施方式】
[0019] 下面結合實施例對本發明做進一步說明。所列的實施例僅作闡示之用，并表明本 發明的精神和范圍并非限于此中的細節及其修改案。
[0020] 本發明所涉及的生物酶及其他試劑均為市場購買，其中試劑均未經進一步純化， 其中，氧化還原酶購自浙江九洲藥業有限公司，為海洋新鞘氨醇桿菌羰基還原酶；輔酶為 NAD或NADP，分別購自合肥博美生物科技責任有限公司和biosharp公司。
[0021] 實施例1本實施例說明獲得修飾后的磁性介孔材料的方法 稱取 I g SBA-15 加入到含有 1.75 g (NH4)2Fe (SO4) 2·6Η20、4· 29 g NH4Fe (SO4) 2·12Η20 的水溶液中，用5 M的氨水調節pH至11~12,65°C攪拌30 min，磁性吸附，獲得含有磁性的 介孔材料SBA-15/Fe304。稱取I g SBA-15/Fe304加入至500 ml乙醇水溶液（V/V=l:l)中， 在氬氣保護下攪拌，加入冰醋酸至pH值到4.0,向體系中逐滴加入50 ml 3-氨丙基三乙 氧基硅烷，60°C攪拌24 h，磁性吸附，乙醇洗滌三次，即得修飾后的磁性介孔材料SBA-15/ Fe3O4HMH2 〇
[0022] 實施例2本實施例說明獲得共固定化酶的方法 稱取50 mg輔酶NAD加入到10 ml含有50 mg/ml羰基還原酶的磷酸鹽緩沖液（pH 7.0)中，4°C靜置I h;在上述溶液中加入1.5 g實施例1中制備的SBA-15/Fe304-NH2,25°C， 100-150 rpm，溫浴8 h，得懸浮液，磁性吸附去上清，沉淀用生理鹽水洗滌，重復三次，得到 的固體即為羰基還原酶與輔酶的共固定化酶，冷凍干燥后于4°C保存備用。
[0023] 實施例3本實施例說明另一共固定化酶