一種胍基丁胺硫酸鹽的生物制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種胍基丁胺硫酸鹽的生物制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 在生物體內(nèi)，胍基丁胺（agmatine)是由左旋精氨酸脫羧酶（L-arginine decarboxylase，L-ADC)作用于精氨酸脫除羧基形成的產(chǎn)物。胍基丁胺作為一個維持運動 營養(yǎng)的補充劑，其功能上的很多方面要優(yōu)于精氨酸，可以幫助使用者提高運動過程中的機(jī) 體耐力，加快運動后的身體恢復(fù)，提尚全身構(gòu)成，包括提尚肌肉量和減少肥胖油脂。狐基丁 胺還有多種藥理學(xué)活性，是一種極具開發(fā)價值的戒毒類藥物。特別是以硫酸鹽的形式廣泛 應(yīng)用于醫(yī)藥和保健品市場。其結(jié)構(gòu)式如下。
[0003] 近年來，國內(nèi)外陸續(xù)有一些制備胍基丁胺硫酸鹽的報道，以采用化學(xué)法為主。中國 專利CN 103755598A公布了以1，4- 丁二胺為原料，以單氰胺水溶液作為胍基化試劑，通過 加成反應(yīng)獲得胍基丁胺，再用硫酸成鹽。中國專利CN101717352A公布了在反應(yīng)溶劑中以 1，4- 丁二胺和0-甲基異脲硫酸鹽為原料在-20~100°C的條件下進(jìn)行縮合反應(yīng)可得到胍 基丁胺硫酸鹽。中國專利CN1834085A和CN 101121677均用1，4_ 丁二胺和S-甲基異脲硫 酸反應(yīng)，得到胍基丁胺硫酸鹽。但采用以上方法制備胍基丁胺硫酸鹽易對環(huán)境造成較大的 污染且收率較低，不利于企業(yè)的節(jié)能減排。
[0004] 目前，利用生物法制備胍基丁胺硫酸鹽實現(xiàn)工業(yè)化的報道并不多見。因此，利用酶 催化技術(shù)建立一個低成本、高效，且制備工藝簡單，有利于工業(yè)化生產(chǎn)的工藝將具有更加廣 泛的應(yīng)用前景。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供了一種胍基丁胺硫酸鹽的生物制 備方法，并將所述方法放大到工業(yè)制備水平，同時還克服現(xiàn)有化學(xué)合成技術(shù)存在的上述諸 多缺陷。
[0006] 為達(dá)到上述的發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是： 一種胍基丁胺硫酸鹽的生物制備方法，該方法L-精氨酸硫酸鹽溶液為底物原料，在生 物催化劑和輔酶的存在下發(fā)生脫羧反應(yīng)得到胍基丁胺硫酸鹽并排出氣體CO2，所述的生物 催化劑采用L-精氨酸脫羧酶，所述的輔酶選用磷酸吡哆醛，該制備方法的反應(yīng)式如下：
[0007] 作為優(yōu)選，所述的底物L(fēng)-精氨酸硫酸鹽溶液濃度為100~300g/L。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的生物催化劑重組L-精氨酸脫羧酶濃度為5~100g/L、所述的輔 酶濃度為〇.〇1~〇.2g/L。
[0009] 作為優(yōu)選，所述的生物催化劑采用通過E. coli克隆表達(dá)得到的重組L-精氨酸脫 羧酶。當(dāng)然本發(fā)明也可以采用常規(guī)的L-精氨酸脫羧酶。
[0010] 作為再優(yōu)選，所述的重組L-精氨酸脫羧酶的制備方法為：將含有L-精氨酸脫羧 酶基因的重組大腸桿菌甘油管或斜面試管轉(zhuǎn)接涂布至含有卡那霉素抗性的LB瓊脂培養(yǎng)基 中，35~37°C活化培養(yǎng)12~16h ;將生長良好的斜面種子加入無菌水或生理鹽水制成菌懸 液，以1%的接種量擴(kuò)大到含有卡那霉素抗性的TB培養(yǎng)液中，35~37°C搖床培養(yǎng)至0D_達(dá) 到3~5時加入誘導(dǎo)劑，降溫至25~30°C繼續(xù)培養(yǎng)12~16h，離心收集濕菌體，加入三倍 質(zhì)量的純化水制成菌懸液后超聲破壁得到所需的粗酶液或反復(fù)凍融濕菌體兩次，備用。
[0011] 作為優(yōu)選，所述的誘導(dǎo)劑為無菌乳糖溶液或無菌異丙基-D-硫代半乳糖苷溶 液。
[0012] 作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)時間為5~25h、反應(yīng)溫度為25~50°C、反應(yīng)pH為4. 0~ 8. 0,反應(yīng)過程的pH用20~50% (V/V)的硫酸溶液進(jìn)行調(diào)節(jié)。
[0013] 作為優(yōu)選，所述的反應(yīng)需避光、通入空氣并充分?jǐn)嚢琛?br>[0014] 本發(fā)明以L-精氨酸硫酸鹽溶液為底物，與L-精氨酸脫羧酶、輔酶(磷酸吡哆醛)攪 拌混合，在一定條件下進(jìn)行脫羧反應(yīng)得到胍基丁胺硫酸鹽。實現(xiàn)轉(zhuǎn)化率多98%，連續(xù)生產(chǎn)時 收率可達(dá)90%。本發(fā)明技術(shù)路線具有制備工藝簡單、生產(chǎn)效率高、成本低等優(yōu)點，重組L-精 氨酸脫羧酶的發(fā)酵和轉(zhuǎn)化工藝可達(dá)到工業(yè)制備水平，從根本上解決了化學(xué)合成制備成本 高、收率低、環(huán)境隱患大等問題。
【附圖說明】
[0015] 圖1為本發(fā)明一個小試制備過程中精氨酸含量與胍基丁胺硫酸鹽含量隨時間的 變化曲線圖。
[0016] 圖2~圖6為轉(zhuǎn)化過程中利用HPLC檢測轉(zhuǎn)化液中精氨酸和胍基丁胺硫酸鹽變化 的一組圖譜。圖2為轉(zhuǎn)化開始前，即Oh時底物精氨酸的出峰圖譜；圖3為轉(zhuǎn)化0. 5h時底物 精氨酸和產(chǎn)物胍基丁胺硫酸鹽的出峰圖譜；圖4為轉(zhuǎn)化2h時底物精氨酸和產(chǎn)物胍基丁胺硫 酸鹽的出峰圖譜；圖5為轉(zhuǎn)化5h時底物精氨酸和產(chǎn)物胍基丁胺硫酸鹽的出峰圖譜；圖6為 轉(zhuǎn)化9h時底物精氨酸和產(chǎn)物胍基丁胺硫酸鹽的出峰圖譜，此時精氨酸含量< lg/L。
【具體實施方式】
[0017] 以下實例和附圖將有利于理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。需要指出的 是，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干等效變化和改進(jìn)。這些都在本發(fā)明的保 護(hù)范圍內(nèi)。
[0018] 實施例1:重組L-精氨酸脫羧酶的小試制備工藝 (1)重組L-精氨酸脫羧酶的小試發(fā)酵 以7L小發(fā)酵罐中5L發(fā)酵裝料量為例： 將含有L-精氨酸脫羧酶基因的重組大腸桿菌甘油管或斜面試管涂布于一支LB瓊脂 斜面試管中，培養(yǎng)基中含有l(wèi)〇〇mg/L的卡那霉素。37°C活化培養(yǎng)13h。向培養(yǎng)好的LB斜面 試管中加入6mL無菌生理鹽水制成菌懸液，取ImL菌懸液接入IOOmL TB搖瓶種子液中，同 時加入IOmg卡那霉素。種子液于35°C、220rpm搖床培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到4~5時接入5L TB 發(fā)酵培養(yǎng)液中。培養(yǎng)條件如下：接種量：100mL/5L (2. 0%);通氣量：Ivvm (5 L/min);罐 壓：0. 04MPa ;攪拌轉(zhuǎn)速：開始時400rpm，3h后增至600rpm。當(dāng)OD6c?達(dá)到5左右時，降溫至 28°C，補第一批乳糖50g (配成溶液150mL);當(dāng)OD6c?達(dá)到15~18時，補第二批乳糖50g (配 成溶液150mL);當(dāng)OD6tltl達(dá)到25左右時，補第三批乳糖40g (配成溶液120mL)。總發(fā)酵時長 約 24h。
[0019] (2)離心收集濕菌體200g，將濕菌體反復(fù)凍融2次后，待用。也