藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2及其編碼的蛋白及應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于基因工程技術領域，涉及藍莓耐鹽、抗旱L0N2蛋白酶基因VcLON2R實編碼的蛋白及應用。
【背景技術】
[0002]干旱和土壤鹽漬化等非生物逆境是當今限制作物產量的主要環境因素，植物的生產量大大關系著人們的生活。干旱發生頻率較高、范圍較廣，全球多數國家均遭受干旱的影響，干旱已經成為全球最嚴重的自然災害之一，每年干旱造成經濟損失達數千億美元。而土壤鹽漬化方面，全世界約有10億公頃的土地存在不同程度的鹽漬化，占世界陸地總面積的約10%，而我國就有近一億公頃鹽漬化土地。因此，提高作物的耐鹽和抗旱能力已經成為現代作物育種工作急需解決的關鍵問題之一。
[0003]利用轉基因技術將具有優良性狀的基因轉入植物中，以此開發高效的轉基因新品種具有廣闊的應用前景。一些研宄已表明將植物本身及其他植物中耐鹽抗旱相關基因轉入植物中，可以提高轉基因植物的耐鹽抗旱能力。
[0004]LON蛋白酶是細胞器中蛋白質質量控制的最主要成分，其可以通過降解損傷或者錯誤折疊的蛋白來控制蛋白的命運，在多種生理過程中都有著重要的作用。然而，目前大多數研宄主要集中在古生菌、原核生物和動物等非植物體中，在植物體內的研宄相對較少。尤其該基因在植物抗逆(生物脅迫或非生物脅迫)中的功能研宄尚無相關報道，因此，對于植物中LON蛋白酶的研宄具有重要的研宄價值和前景。特別是幾乎沒有關于藍莓VcLO釀抗逆等功能方面的研宄。
【發明內容】
[0005]為了解決現有技術中的問題，本發明提出一種提高植物耐鹽、抗旱性的藍莓L0N2蛋白酶基因KcZftV么所述KcZftVi基因cDNA核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
[0006]本發明提出一種藍莓耐鹽、抗旱基因KcZftVi的克隆方法，提取藍莓RNA，將其反轉錄為cDNA，以cDNA為模板，以下述序列為引物，通過RT-PCR獲得KcZftVi基因序列，引物序列為:
VcL0N2-F:5，-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ ；
VcL0N2-R:5’ -TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ 。
[0007]本發明還提出一種藍莓耐鹽、抗旱基因KcZftVi編碼的蛋白質，其氨基酸序列為SEQ ID N0.2 所示。
[0008]本發明提出一種權利要求1所述的藍莓耐鹽、抗旱基因KcZftVi在培育耐鹽、抗旱植物中的應用。
[0009]進一步的，所述植物是煙草、玉米、水稻、小麥和藍莓。
[0010]本發明還提出一種植物超表達載體，其含有藍莓耐鹽、抗旱基因VcLON2。
[0011]進一步的，所述植物超表達載體為pSH737-CaMV35S- VcLON2。
[0012]此夕卜，本發明還提出一種提高耐鹽性和抗旱性的方法，利用pSH737-CaMV35S- KcZftVi借助于基因工程手段介導植物遺傳轉化，獲得的轉基因植物。
[0013]本發明的有益效果:利用現有的植物基因工程技術，利用電子克隆及RT-PCR技術，分離與鑒定藍莓耐鹽、抗旱相關基因序列信息，并通過根癌農桿菌介導法將基因轉入本氏煙，經過耐鹽、抗旱表型鑒定證明轉入KcZftVi基因的植株耐鹽力和抗旱力明顯提高。
【附圖說明】
[0014]圖1為KcZftVi基因全長cDNA序列的擴增結果；
圖2為實時熒光定量PCR法(qRT-PCR)分析鹽脅迫和干旱脅迫下KcZftVi的表達情況； 圖3 -a為大腸桿菌pMD19-T- VcLON2 PCR檢測電泳結果；
圖3-b為pSH737質粒和目的基因酶切圖；
圖4為KcZftVi轉基因本氏煙植株的PCR鑒定；
圖5為轉基因本氏煙及野生型在鹽脅迫和干旱脅迫處理30 d后的生長情況；
圖6為轉基因本氏煙及野生型在鹽脅迫和干旱脅迫處理30d后的株高、根長、鮮重和干重。
【具體實施方式】
[0015]實施實例1、KcZftVi基因的獲得 1.1RNA的提取
(1)取藍莓組織0.1-0.2 g于研缽中，用液氮研磨成粉末狀并快速轉移至事先65°C預熱的2 mL離心管(離心管中盛有0.9 mL CTAB提取液(20 g/L CTAB、20 g/L PVPUOO mmol/L Tris-HCl (pH 8.0),25 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl)+30 μ L β-巰基乙醇)中，用渦旋震蕩儀震蕩均勻；置于65°C水浴鍋中預熱10 min，期間顛倒混勻3次；
(2)水浴后7000r/min離心5 min，取上清，加入1/3體積的5 mol/L醋酸鉀(pH 4.8)混勻后冰浴30 min,再加入700 μ L氯仿/異戊醇(24:1)渦旋混勻；
(3)4°C下12000 r/min離心5 min，取上清，加入500 μ L水飽和酚(pH 5.2)混勻后，再加入500 μ L氯仿/異戊醇(24:1)渦旋混勻；
(4)4°C下12000 r/min離心5 min，取上清，加入等體積的氯仿/異戊醇(24:1)禍旋混勻；
(5)4°C下12000 r/min離心5 min，取上清，加入等體積的異丙醇混勾后冰浴沉淀30
min ；
(6)40CT 12000 r/min離心10 min，去上清，加入I mL 75%酒精洗滌沉淀兩次；
(7)室溫自然干燥10min，適量DEPC水溶解，得到藍莓RNA，-80°C保存備用。
[0016]1.2 cDNA 的合成
本發明所用的反轉錄試劑盒為:PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis kit(TaKaRa)0
[0017]I) 10 uL 體系:01igo dT Primer (50 μ Μ) I μ L dNTP Mixture (10 mM each)I μ L Total RNA <5 μ g RNase free dH20Up to 10 μ L
2)65°C變性5min，迅速插入冰中，然后依次加入:
上述變性后反應液10 UL
RNase free dH204.5 μ L
5 X PrimeScript Buffer4 μ L
RNase Inhibitor (40 U/μ L)0.5 μ L
PrimeScript RTase (200 U/μ L )I μ L
3)輕輕混勻步驟2得到的反應液，42°C反應Ih ;
4)70°C保溫15min，使酶失活，冰上放置冷卻，-20 °C保存備用。
[0018]1.3 cDNA 的克隆
1.3.1完整ORF預測及引物設計
根據葡萄的LO纖因cDNA序列(XM_002282621.2)對NCBI中的藍莓EST庫進行比對分析，獲得一系列同源 EST 序列(SRR353286.100950.2、SRR353286.98047.2、SRR353287.39645.2、SRR353282.58737.2、SRR353291.8534.2、SRR353285.2047.2、SRR353283.12456.2、SRR353285.54358.2)。拼接序列，經基因預測，然后用軟件 ORF Finder(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測完整 0RF。
[0019]在ORF 序列兩側設計上游引物 VcL0N2-F:5’-ATGGCGGAATCGGTCGAGCT-3’ (SEQ IDN0.3)和下游引物 VcL0N2-R:5’ -TCATAACTTTGAGTGTTGTCTCC-3’ (SEQ ID N0.4)，用藍莓cDNA (由步驟1.2合成的)進行RT-PCR。
[0020]1.3.2 PCR 擴增 KcZftVJ PCR反應體系(25 yL)
10XLA PCR Buffer II (Mg2+ Plus)2.5 μ L
dNTP Mixture (各 2.5 mM)2.0 μ L
SEQ ID N0.31.0 yL
SEQ ID N0.41.0 yL
藍莓cDNA (由步驟1.2合成的)l.0yL
LA Taq (5 U/ μ L)0.25 μ L
ddH2017.25 μ L
1.3.3 PCR 擴增程序:94°C 4 min ；94°C 30 sec, 60°C 30 sec, 72°C 3 min，30 個循環；72°C 15 min ;4°C保溫。
[0021]1.3.4擴增得到該基因的ORF序列，回收擴增產物，并克隆到pMD19_T載體，篩選陽性克隆，測序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
[0022]1.3.5得到包含整個編碼框的VcLon2 cDNA序列，全長2667 bp，如圖1所示。測序結果與預測的ORF進行比對，序列相似度為98%。
[0023]1.4基因表達分析(qRT-PCR)
1.4.2鹽脅迫和干旱脅迫下RNA的提取
將2年生的藍莓苗‘戴安娜’和‘澤西’從土中取出，洗去根上的泥土，預培養I周后，以浸在Hogland營養液中為對照組，將苗分別浸在含200 mM NaCl (鹽脅迫)和2% PEG6000(干旱脅迫)的Hogland營養液中處理24 h，取葉片提取RNA，提取方法與實施例1中的1.1RNA的提取方法相同，在此不再贅述。
[0024]1.4.3 cDNA 的合成
合成方法與實施例1中的1.2 cDNA的合成方法相同，在此不贅述。
[0025]1.4.4 PCR 反應以cDNA為模板，引物為
VcL0N2-DL-F:5’ -CCTTTCAAAGGTTGTATTTGTGGC-3’ (SEQ ID N0.5)
VcL0N2-DL-R:5’ - AACTCGTGGAATGAGATGTCGC-3’ (SEQ ID N0.6)qRT-PCR反應體系:
SEQ ID N0.5 (10 μΜ)0.4 μ L
SEQ ID N0.6 (10 μ Μ)0.4 μ L
cDNA 模板1.0 μ L
SYBR Premix Ex Taq II (Tli ENaseH Plus), ROX plus 10 μ LddH208.2 μ L
PCR程序
用 Applied B1systems 7500 Fast Real-Time PCR System 進行 qRT-PCR，米用兩步法 PCR 擴增標準程序:95°C 30 s ； 95°C 5 s，58°C 35 s，總共 40 個循環；95°C 15 sec，58°C I min, 95°C 15 sec進行qRT-PCR檢測，并使用2_Λ AGt法進行計算分析。
[0026]結果表明:參考圖2在鹽脅迫和干旱脅迫下藍莓‘戴安娜’和‘澤西’的VcLON2敦達量均上調10倍以上，這說明其可能有利于提高植物對鹽脅迫和干旱脅迫的耐受性。
[0027]實施例2、植株