一種中性植酸酶突變體及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于基因工程技術領域，具體內容涉及一種中性植酸酶突變體及其在水產 飼料中的應用。 技術背景
[0002] 磷是魚類所必需的重要礦物元素之一，魚體對磷的需要量高于其他礦物元素但飼 料中過量的磷被認為是造成水體富營養化的重要因素之一。因此，通過提高魚類對原料中 磷的利用率，適當調整飼料中磷的含量，使其更接近魚的需要量，來降低養殖魚類磷的排放 量，是減少水環境污染的重要途徑。
[0003] 植酸酶作為一種由微生物發酵生產的酶制劑，可分解植酸和植酸鹽，促進飼料中 植酸和植酸鹽的分解，使磷、磷酸根結合的內源性酶和其它營養素得以釋放和利用，減少糞 磷對環境的污染，節省無機磷酸鹽的添加。多項研宄證明，在水產養殖中植酸酶替代部分磷 酸二氫鈣表現出了較好的養殖效果和環境效益。羅琳等（2007)在基本花鱸試驗研宄表明 用中性植酸酶部分替代磷酸二氫鈣是完全可行的，并得出中性植酸酶l〇〇〇U/kg替代80% 左右的磷酸二氫鈣綜合生長效果最佳，也證明中性植酸酶存在一定的廣譜應用性。近期研 宄還表明中性植酸酶在有胃和無胃水產動物均表現較好性能，可以在水產動物胃腸道中釋 放大量的有效磷。
[0004] 但當前市場上的植酸酶以酸性植酸酶為主，在pH 2. 5和5. 5條件下活性最高，而 在無胃水產動物消化道中，由于沒有胃酸的分泌，消化道中PH約呈中性，不利于酸性植酸 酶發揮作用。因此目前急需開發一種在中性PH范圍內具有較高酶活的植酸酶。
【發明內容】
[0005] 本發明為解決現有技術問題，提供了一種中性植酸酶突變體及其應用。本發明通 過隨機突變的方法對植酸酶PHYA進行改造，獲得一種突變體蛋白，其pH適用范圍更偏向中 性條件，有利于其在水產飼料中的廣泛應用。
[0006] 本發明一方面提供了一種植酸酶，其氨基酸序列為SEQ ID NO :1。
[0007] 所述植酸酶的一種編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO :2。
[0008] 本發明另一方面提供了一種植酸酶突變體，是氨基酸序列為SEQ ID NO :1的植酸 酶的第87位氨基酸由Ser變為Arg，第159位氨基酸由Gly變為Lys，第198位氨基酸由 Ser 變為 Asp。
[0009] 上述植酸酶突變體的氨基酸序列為SEQ ID NO :3,其一種編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4〇
[0010] 本發明另一方面提供了攜帶有編碼序列為SEQ ID NO :3的植酸酶突變體基因的質 粒。
[0011] 本發明再一方面提供了一種重組黑曲霉，是將上述質粒轉入黑曲霉中構建得到 的。
[0012] 本發明還提供了上述植酸酶突變體在水產飼料中應用。
[0013] 本發明篩選到的植酸酶突變體PHYAT3最適反應pH為6. 5,在pH6. 5-7. 0范圍內， 能保持80%以上的酶活，當pH為8. 0時，仍能保持20%的酶活，取得了意料不到的技術效 果。與野生型相比，植酸酶突變體PHYAT3在中性范圍內的酶活水平得到顯著提高，最適反 應溫度未發生明顯變化。所述植酸酶突變體可廣泛應用于水產飼料中，從而有利于減少飼 料中無機磷酸鹽的添加，降低養殖成本，同時還能有效減少水產動物糞磷對環境的污染。
【附圖說明】
[0014] 圖1為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的pH-相對酶活曲線圖；
[0015] 圖2為植酸酶PHYA、PHYAT3和PHYAT5的溫度-相對酶活曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 本發明用到了遺傳工程和分子生物學領域使用的常規技術和方法，例如 MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL, 3nd Ed. (Sambrook,2001)和 CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel, 2003)中所記載的方法。這些一般性參考文獻 提供了本領域技術人員已知的定義和方法。但是，本領域的技術人員可以在本發明所記載 的技術方案的基礎上，采用本領域其它常規的方法、實驗方案和試劑，而不限于本發明具體 實施例的限定。
[0017] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行詳細描述。
[0018] 實施例1植酸酶基因的獲得
[0019] 根據公共基因數據庫中的基因序列，優化了合成基因的密碼子并人工合成來源于 黑曲霉（Aspergillus niger)的植酸酶基因 PHYA (序列為SEQ ID NO :2)，其編碼的氨基酸 序列為 SEQ ID NO :1。
[0020] PCR引物和反應條件如下：
[0021] 引物 I (F) :GCGCGAATTCATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0022] 引物 2(R) :TAAAGCGGCCGCTTAGGCGAAGCACTCGGC
[0023] 反應條件為：94°C變性5min ;然后94°C變性30s，56°C復性30s，72°C延伸I. 5min， 30個循環后，72°C保溫10min。瓊脂糖電泳結果顯示，PHYA基因大小為1395bp。
[0024] 實施例2植酸酶突變體的構建及篩選
[0025] 為了提高植酸酶PHYA的在中性條件下的酶活水平，申請人通過定向進化技術對 該酶進行了大量突變的篩選。
[0026] 以PHYA基因為模板，以實施例1所述引物1、2用GeneMorph II隨機突變PCR試 劑盒（Stratagene)進行PCR擴增，膠回收PCR產物，EcoRI、NotI進行酶切處理后與經同樣 酶切后的pET21a載體連接，轉化至大腸桿菌BL21 (DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37°C倒置 培養，待轉化子出現后，用牙簽逐個挑至96孔板，每個孔中加入150ul含有0.1 mM IPTG的 LB+Amp培養基，37°C 220rpm培養6h左右，離心棄上清，菌體用pH 5. 0的緩沖液重懸，反復 凍融破壁，獲得含有植酸酶突變子的大腸桿菌細胞裂解液。
[0027] 分別取出40 μ 1裂解液至兩塊新的96孔板，其中一塊稀釋到pH 5. 0的緩沖液中， 另一塊稀釋到PH 7. 0的緩沖液中，分別加入相同pH值的20 μ 1底物，于37°C反應30min 后，加入40ul終止液混勻以終止反應，室溫放置IOmin顯色，分光光度計415nm處測定吸光 值。實驗結果顯示：大部分植酸酶突變體在pH 5. 0條件下的酶活高于在pH 7. 0條件下的 酶活，只有少數突變體在PH 7.0條件下酶活高于在pH 5.0條件下的酶活，還有一些突變體 在pH 5.0和pH 7.0條件下的酶活水平比突變前均大幅下降。申請人通過對在pH 7.0條件 下的酶活水平顯著高于在pH 5. 0條件下酶活的突變體進行DNA測序，最終獲得了能提高植 酸酶PHYA在中性pH范圍內酶活水平的突變組合：S87R、G159K、S198D三點突變體和A66P、 N102R、S189R、S190P、T270K 五點突變體。
[0028] 將S87R、G159K、S198D三點突變體命名為PHYAT3,其氨基酸序列為SEQID NO :3， 其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :4。
[0029] 將A66P、N102R、S189R、S190P、T270K五點突變體命名為PHYAT5,其氨基酸序列為 SEQ ID NO :5,其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO :6。
[0030] 實施例3重組表達載體的構建
[0031] 利用PCR分別擴增植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5的基因片段，引物兩端引入 XbaI位點。引物序列如下：
[0032] 引物 3(F) ：GCTCTAGAATGAGCTTCCGGTCCCTG
[0033] 引物 4(R) ：GCTCTAGATTAGGCGAAGCACTCGGC
[0034] PCR反應條件為：94 °C變性5min ;然后94 °C變性30s，56 °C復性30s，72 °C延伸 I. 5min，30個循環后，72°C保溫lOmin。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示，PHYAT3、PHYAT5基因為 大小1395bp的片段。
[0035] 將上述獲得的植酸酶突變體PHYAT3和PHYAT5基因片段與表達載體pGAU分別進 行限制性內切酶XbaI單酶切，酶切