植物耐逆性相關蛋白TaWPK及其編碼基因與應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種植物耐逆性相關蛋白TaWPK及其編碼基因與應用。
【背景技術】
[0002] 干旱、高鹽及低溫等逆境脅迫是影響小麥生長、發育的障礙因子。因此，了解小麥 對逆境條件的應答與信號傳導機制，提高小麥品種的抗逆性，成為小麥遺傳研究及小麥品 種改良的重要任務之一。
[0003] 在逆境脅迫下植物體內會產生一系列應答反應，伴隨著許多生理生化及發育上的 變化。明確植物對逆境的反應機制，將為抗逆基因工程研究和應用提供科學論據。目前，植 物抗逆性研究已逐漸深入到細胞、分子水平，并與遺傳學和遺傳工程研究相結合，探索用生 物技術來改進植物生長特性，其目的是提高植物對逆境的適應能力。
[0004] 在干旱、高鹽和低溫等環境脅迫的逆境條件下，植物能夠在分子、細胞和整體水平 上做出相應的調整，以最大程度上減少環境所造成的傷害并得以生存。許多基因受脅迫誘 導表達，這些基因的產物不僅能夠直接參與植物的脅迫應答，而且能夠調節其它相關基因 的表達或參與信號傳導途徑，從而使植物避免或減少傷害，增強對脅迫環境的抗性。與脅迫 相關的基因產物可以分為兩大類：第一類基因編碼的產物包括離子通道蛋白、水通道蛋白、 滲透調節因子(蔗糖、脯氨酸和甜菜堿等）合成酶等直接參與植物脅迫應答的基因產物；第 二類基因編碼的產物包括參與脅迫相關的信號傳遞和基因表達調節的蛋白因子，如蛋白激 酶、轉錄因子等。其中，蛋白激酶在植物脅迫信號的感知、傳遞的調控中起著重要作用。
[0005] 到目前為止，已發現的蛋白激酶約有300種左右，分子內都存在一個同源的由約 270氨基酸殘基構成的催化結構區。在細胞信號傳導、細胞周期調控等系統中，蛋白激酶形 成了縱橫交錯的網絡。這類酶催化從ATP轉移出磷酸并共價結合到特定蛋白質分子中某些 絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基的羥基上，從而改變蛋白質、酶的構象和活性。
[0006] 目前，在植物中已知的與脅迫相關的蛋白激酶主要有：絲氨酸/蘇氨酸蛋白激 酶如 MAPK (mitogen-activated protein kinase), CDPK (calcium-dependent protein kinase);酪氨酸蛋白激酶如Src家族、Tec家族、ZAP70、家族、JAK家族；還有一種絲氨酸/ 蘇氨酸/酪氨酸雙特異性蛋白激酶，如DYRK相關的蛋白激酶，CDC25等。這三類蛋白激酶 均有文獻報道參與植物相應外界環境脅迫的信號傳導過程，提高植物對外界逆境的適應能 力。
[0007] 根據蛋白激酶的磷酸化氨基酸殘基的種類，蛋白激酶可以分為Ser/Thr蛋白激 酶，Tyr蛋白激酶以及雙特異性Ser/Thr/Tyr蛋白激酶。Ser/Thr蛋白激酶主要包括MAPK， CDPK，JNK等。這種類型的蛋白激酶目前研究的較多，并且在信號傳導途徑中起重要作用。而 酪氨酸蛋白激酶分為兩類，一類是非受體型酪氨酸蛋白激酶，以src基因產物為代表，此外 還有￥68、？711、]^^、？81'、1^11、？口8/^68及4131等 ；另一類是受體型酪氨酸蛋白激酶，根據它們 的結構不同，受體型酪氨酸激酶可以分為9種類型。在動物細胞中，酪氨酸蛋白激酶往往參 與程序性細胞死亡、癌變等重要細胞行為。植物中酪氨酸蛋白激酶研究較晚。Maya Mayrose 等人的工作表明，西紅柿中的雙特異性激酶LeMPK3能夠提高植物對病原體的抵抗。文獻提 出，在受到病原體的侵害后，LeMPK3激酶的活性首先提高，然后LeMPK3的mRNA的表達量也 短暫的提高。2002年，Parvathi Rudrabhatla等人從花生cDNA文庫中得到一個雙特異性 蛋白激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸蛋白激酶活性。并且發現，該激酶的mRNA表達水 平以及激酶活性受到低溫和高鹽脅迫的誘導。但是其蛋白表達水平卻沒有明顯的變化。在 250mM濃度的NaCl處理24h下，STY的mRNA表達水平提高了 20倍，在4°C條件下處理24h， 其mRNA表達水平提高了 50倍左右。在IOOmMABA處理下，STY表達量沒有變化。
[0008] 目前，在許多植物中都發現蛋白激酶參與抗病，抗逆境等信號傳遞過程（Parvathi Rudrabhatla，2002 ;Lizhong Xiong，2003)。Parvathi Rudrabhatla 等認為，花生中的一種 STY激酶參與了花生對非生物脅迫的起始相應，證明了一種非MPK途徑的蛋白激酶級聯信 號傳遞過程在非生物脅迫中起重要作用。Lizhong Xiong等人認為，水稻蛋白激酶0sMAPK5 能夠提高水稻對低溫，干旱，高鹽以及病害等的抗性。而Jen Sheen認為，鈣離子依賴的蛋 白激酶CDPK (CDPKland CDPKla)能夠激活與植物抗逆境相關基因的啟動子，參與植物逆境 信號傳導過程。Riichiro Yoshida等報道，在擬南芥中ABA誘導的蛋白激酶SnRK2在植物 響應脫水脅迫的信號傳導過程中起到重要的作用。由于植物的逆境耐性是由多基因調控的 復雜性狀，依靠導入單個功能性蛋白基因很難實現植物抗逆性的綜合提高。因此，利用一個 關鍵性轉錄因子促進多個功能基因的表達，從而增強植物的抗逆性，已經成為植物抗逆基 因工程的研究熱點。
[0009] 綜合目前的研究結果，蛋白激酶在植物響應逆境脅迫的信號傳導途徑中占有重要 的地位。蛋白激酶通過自身的磷酸化提高或者降低自身的激酶活性，通過磷酸化底物提高 或者降低底物蛋白的酶活性，然后底物蛋白又調控下游基因的酶活，形成一個級聯調控途 徑。如RAS信號調控途徑，在細胞受體酪氨酸蛋白激酶感受到配體的信號后，形成二聚體并 發生自身磷酸化，激活RAS，然后由活化的RAS激活引起蛋白激酶的級聯反應。這種級聯調 控是一種很精密很復雜的調控網絡，蛋白激酶可能在上游作為一種開關在行使其功能。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的是提供一種植物耐逆性相關蛋白TaWPK及其編碼基因與應用。
[0011] 本發明提供的一種蛋白，為如下（1)或（2)所示：
[0012] (I) SEQ ID No. 2 所示的蛋白；
[0013] (2)將SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或 缺失和/或添加且功能相同的蛋白質。
[0014] 上述蛋白的編碼基因也屬于本發明的保護范圍。
[0015] 上述編碼基因中，所述編碼基因為如下中至少一種：
[0016] I) SEQ ID No. 1 所示的 DNA 分子；
[0017] 2)在嚴格條件下與1)限定的DNA分子雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；
[0018] 3)與1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同一性且編碼所述蛋白質的DNA 分子。
[0019] 含有上述任一所述編碼基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌也屬于 本發明的保護范圍。
[0020] -種制備耐逆性增強的轉基因植物的方法也屬于本發明的保護范圍，包括如下步 驟：將上述任一所述編碼基因導入出發植物中，得到轉基因植物；與出發植物相比，轉基因 植物的耐逆性增強；
[0021] 所述耐逆性具體為耐鹽性、耐水楊酸性、耐脫落酸性和/或耐干旱性；
[0022] 所述耐逆性增強具體為在鹽脅迫下，所述轉基因植物的種子萌發率比所述出發植 物的種子萌發率高、所述轉基因植物的種子萌發速率比所述出發植物的種子萌發速率快和 /或所述轉基因植物的主根比所述出發植物的主根長；在水楊酸脅迫下，所述轉基因植物 的種子萌發率比所述出發植物的種子萌發率高、所述轉基因植物的種子萌發速率比所述出 發植物的種子萌發速率快；在脫落酸脅迫下，所述轉基因植物的主根比所述出發植物的主 根長；在干旱脅迫下，所述轉基因植物的側根比所述出發植物的側根長；
[0023] 所述鹽脅迫具體為80mM NaCl的環境或140mM NaCl的環境；
[0024] 所述水楊酸脅迫具體為IOuM水楊酸的環境；
[0025] 所述脫落酸脅迫具體為IOuM ABA的環境；
[0026] 所述干旱脅迫具體為含有5g/100ml的PEG的環境。
[0027] 上述方法中，所述編碼基因是通過重組表達載體導入的，所述重組表達載體是將 所述編碼基因插入出發載體PBI121的多克隆位點得到的。
[0028] 上述任一所述的方法中，所述植物為擬南芥。
[0029] 上述蛋白、上述任一所述的編碼基因在提高植物耐逆性中的應用也屬于本發明的 保護范圍；
[0030] 所述耐逆性具體為耐鹽性、耐水楊酸性、耐脫落酸性和/或耐干旱性。
[0031] 上述應用中，所述植物為擬南芥。
[0032] 本發明提供的蛋白質TaWPK，為絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，來源于小麥屬小麥 (Triticum aestivum L·)，該蛋白由710個氨基酸殘基組成。本發明提供的TaWPK蛋白的 編碼基因 TaWPK在脫落酸、干旱、高鹽和水楊酸的誘導下表達，且將TaWPK基因導入擬南芥 中得到的轉基因擬南芥，對以上四種逆境的抗性高于野生型擬南芥。本發明提供的TaWPK 蛋白及其編碼基因為人為控制抗逆和耐逆相關基因的表達提供了基礎，將在培育抗逆性和 耐逆性增強的植物中發揮重要的作用
【附圖說明】
[0033] 圖1為TaWPK蛋白的結構分析。
[0034] 圖2為TaWPK基因在脅迫誘導表達后的實時熒光定量PCR圖譜。
[0035] 圖3為野生型擬南芥和轉基因擬南芥高鹽逆境脅迫下的種子萌發實驗結果。
[0036] 圖4為野生型擬南芥和轉基因擬南芥高鹽逆境脅迫根長實驗結果。
[0037] 圖5為野生型擬南芥和轉基因擬南芥在外源SA處理下的種子萌發實驗結果。
[0038] 圖6為野生型擬南芥和轉基因擬南芥在外源ABA處理下根長實驗結果。
[0039] 圖7為野生型擬南芥和轉基因擬南芥在5g/1