一種高活力原代軟骨細胞的制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種原代軟骨細胞的制備方法，尤其涉及一種高活力原代軟骨細胞的 制備方法，該方法可以顯著提高軟骨細胞原代培養的效率。
【背景技術】
[0002] 原代軟骨細胞在體外培養一般經過3-4次傳代擴增后，細胞形態逐漸變的肥大， 軟骨細胞特異性基因如II型膠原和蛋白多聚糖等表達丟失，這些都不利于科研研宄需要。 為保證實驗結果的可靠，通常取傳代1-2次的細胞，這就需要大量軟骨細胞。
[0003] 傳統的軟骨細胞培養方法，一般包括如下步驟：
[0004] 出生24小時內的幼鼠，取四肢關節處軟骨，PBS清洗干凈，眼科剪刀剪碎，加5ml的 0. 1 % II型膠原酶于37°C消化1-1. 5小時，取上清后，1000 rpm離心10分鐘沉淀上清液中的 細胞，組織沉淀再加5ml的0. 1 % II型膠原酶消化1-1. 5小時，重復此過程至少4-5次。細 胞培養于含10%胎牛血清DMEM高糖培養基中，置于37°C，5% 0)2培養箱中培養。
[0005] 目前原代培養過程中，原代軟骨細胞不易從軟骨基質上脫落下來，造成得率不高 的問題，因此亟需研發一種提高原代軟骨細胞得率的培養方法。
【發明內容】
[0006] 本發明要解決的技術問題是提供一種高活力原代軟骨細胞的制備方法，為克服現 有技術存在的問題，本發明通過改進關鍵的培養步驟，得到大量的軟骨細胞。通過提高軟骨 細胞原代培養的得率，顯著減少基礎科研中所需的動物及提高臨床人體軟骨標本的使用效 率，為研宄骨關節炎的研宄奠定實驗基礎，提高科研效率。
[0007] 為解決上述技術問題，本發明提供一種高活力原代軟骨細胞的制備方法，包括如 下步驟：
[0008] 步驟1，取幼鼠四肢關節處軟骨，剔除干凈軟組織，剩余透明的軟骨組織，放入盛有 PBS緩沖液的培養皿中，清洗數次，直至殘留的血液漂洗干凈；
[0009] 步驟2,加入0. 1 %質量分數的II型膠原酶保持組織在切割過程中的濕潤，采用手 術專用的刀片進行軟骨組織切碎；
[0010] 步驟3,用0. 1%的II型膠原酶加入切碎的軟骨組織中，移入無菌離心管中，置于 恒溫搖床中搖動；置于離心機中1500-2000rpm，離心10-15min，棄去上清液，留下細胞沉 淀，加入0. 1 %的II型膠原酶繼續放置搖床中消化，用Iml槍頭吹打數次后，軟骨細胞從軟 骨基質上脫離下來，置于離心機中1500-2000rpm，離心10-15min，留取軟骨細胞沉淀；
[0011] 步驟4,將軟骨細胞沉淀種植于培養皿中，培養于含10% FBS的DMEM高糖培養基 中，得到高活力原代軟骨細胞。
[0012] 作為本發明優選的技術方案，步驟2中，所述采用手術專用的刀片進行軟骨組織 切碎需要5min。
[0013] 作為本發明優選的技術方案，步驟3中，所述置于恒溫搖床中搖動具體為：置于 37°C的150rpm恒溫搖床中，搖動3小時吹打一次。
[0014] 作為本發明優選的技術方案，步驟3中，所述加入0. 1%的II型膠原酶繼續放置搖 床中消化具體為消化1小時。
[0015] 作為本發明優選的技術方案，步驟3中，步驟3中，所述用Iml槍頭吹打10-20次， 直至看不到組織團塊為止。
[0016] 作為本發明優選的技術方案，步驟4中，所述將軟骨細胞沉淀種植于培養皿中，細 胞密度為70% -80%。
[0017] 作為本發明優選的技術方案，步驟4中，將軟骨細胞沉淀種植于培養皿中，培養于 含10% FBS的DMEM高糖培養基中，1小時后細胞進行換液和拍照，光鏡下，見細胞均貼壁， 細胞呈短棒形。
[0018] 步驟3中，所述離心機可以是水平離心機或垂直離心機，優選水平離心機。
[0019] 在本發明中，所述"原代軟骨細胞"是指直接從出生24小時的幼鼠四肢關節提取 和培養的軟骨細胞。
[0020] 所述"含10% FBS的DMEM高糖培養基"是指90ml的DMEM高糖培養基加 IOml的 胎牛血清（FBS)。
[0021] 所述"手術專用的刀片"是指帶有刀柄的那種可裝卸的一次性無菌刀片。
[0022] 所述"PBS緩沖液"是指磷酸鹽緩沖液，用于細胞傳代或原代制備時的一種緩沖液。
[0023] 和現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明主要在于軟骨組織塊的剪碎 和離心速度上進行改進，同時最后增加了 Iml槍頭吹打的步驟。在操作中發現團塊的大小 對膠原酶消化的程度有很大差異，通過手術刀片可迅速的剪碎組織，使組織塊盡可能小，利 于酶的消化，縮短了在酶中消化的時間，避免酶對細胞的損傷。同時既往研宄中，一般用 1000 rpm的速度離心軟骨細胞，軟骨細胞由于消化后，在一定較高濃度的軟骨基質中，常規 的離心方法不容易沉淀軟骨細胞，通過增加離心速度（將離心速度提高至1500-2000rpm)， 使離心速度在合適大小，又不至于破壞軟骨細胞，從而提高軟骨細胞的得率，同時保持軟骨 細胞的活力。最后增加槍頭吹打的環節，使軟骨細胞進一步從附著的軟骨基質上脫離下來。
[0024] 與傳統的軟骨細胞提取方法相比，本發明方法在時間上縮短一半，在軟骨細胞的 得率上提高至少提高了 10倍（參見本發明實施例4的表1)，且經實驗驗證所得軟骨細胞有 良好的增殖率和細胞形態。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發明實施例1中制得的原代軟骨細胞的光鏡示意圖。
[0026] 圖2是本發明實施例1中制得的原代軟骨細胞的增殖曲線圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面結合附圖和實施例對本發明作進一步詳細的說明。
[0028] 實施例1
[0029] 1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢關節處軟骨，盡量剔除干凈軟組織，剩余 透明的軟骨組織，放入盛有PBS緩沖液的培養皿中，清洗數次，直至殘留的血液漂洗干凈。 PBS緩沖液的制備：PBS片劑購自于Biowest公司，將PBS片劑直接溶于水獲得PBS緩沖液。
[0030] 2.加入少量（約11111)0.1%質量分數的11型膠原酶（06885,518111&-41(11^11)保持 組織在切割過程中的濕潤，由于軟骨組織富有彈性，且來源于幼鼠，組織塊比較小，一般的 眼科剪，剪碎時容易滑脫，也不容易剪碎，直接影響膠原酶消化的程度，最終影響軟骨細胞 的得率。本發明則采用手術專用的刀片（購自上海醫療器械（集團）有限公司）進行樣品 切碎，由于刀片鋒利，明顯比剪刀易于切碎，一般此過程需要5min，大大縮短此過程所需時 間。0. 1%質量分數的II型膠原酶的制備：稱量0.1 g的市場購買的II型膠原酶粉末溶解于 100ml PBS溶液中。
[0031] 3.剪碎后，用0. 1 %的II型膠原酶加入切碎的軟骨組織中，移入50ml無菌離心 管中，置于37°C的150rpm恒溫搖床中，搖動3小時左右，吹打一次。置于水平離心機中 1500rpm，離心10min，棄去上清液，留下細胞沉淀，加入0. 1 %的II型膠原酶繼續放置搖床 中，消化1小時，用Iml槍頭吹打10次后，軟骨細胞從軟骨基質上脫離下來，置于水平離心 機中1500rpm，離心15min，留取軟骨細胞沉淀。
[0032] 4.將軟骨細胞沉淀分別種植于6-8個IOcm直徑的培養皿，約70% -80%的密度， 培養于含10% FBS (胎牛血清）的DMEM高糖培養基（FBS為胎牛血清，購自Biowest公司， DMEM高糖培養基也購自Biowest公司）中，約1小時后，細胞進行換液和拍照。光鏡下，可 見細胞均貼壁，細胞呈短棒形，約70% -80%的細胞密度（見圖1)。對提取的細胞進行增殖 檢測，按照2000個細胞/孔的密度種植于96孔板中，于檢測第一天至第七天的490處的吸 光度值，從圖2所示的增殖曲線看，可以看出，隨著時間推后，0D490值逐漸增大，提示軟骨 細胞在不斷增殖。進一步表明，通過此方法提取的軟骨細胞具備增殖能力。
[0033] 實施例2
[0034] 1.出生24h，雌雄不限幼鼠6只，取其四肢關節處軟骨，盡量剔除干凈軟組織，剩余 透明的軟骨組織，放入盛有PBS緩沖液的培養皿中，清洗數次，直至殘留的血液漂洗干凈。 PBS緩沖液的制備：PBS片劑購自