一種海藻糖合酶生產菌株及其應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種海藻糖合酶生產菌株及其應用，屬于生物工程和酶工程技術領域。
【背景技術】
[0002]海藻糖(Trehalose，a-D-glucopyranosyl-a -D-glucopyranoside)是由 2 個葡萄糖分子通過α，α-1，I糖苷鍵結合而成的非還原性雙糖，化學性質非常穩定，廣泛存在于自然界中。海藻糖無色無嗅，具有很強的熱穩定性、酸穩定性和化學穩定性，使其具有保護生物細胞和生物活性物質在高溫、脫水、冷凍、干旱、有毒試劑及高滲透壓等不良環境條件下活性免遭破壞的功能，因此在作物育種、食品、藥品、精細化工及生物制品等領域有著廣泛的應用前景。并且大量研宄結果表明，海藻糖是蛋白質、生物膜、醫藥制劑和動植物組織和器官的優質保護劑。20世紀90年代初，海藻糖的制備方法主要是提取法和微生物發酵法，隨著一些可生成海藻糖的新型酶制劑的發現，酶催化法成為研宄的熱點。
[0003]海藻糖合酶是一類分子內轉糖苷酶，能夠把α，α -1，4糖苷鍵連接的麥芽糖一步轉化為α，α -1，I糖苷鍵連接的海藻糖。海藻糖合酶在麥芽糖和海藻糖之間的轉糖苷作用是一個可逆的過程，但大部分都傾向于海藻糖的生成反應。在不同來源的海藻糖合酶中，Thermobifida fuca的海藻糖合酶25°C時轉化率約為60% ；Picrophius torridus的海藻糖合酶 20°C時轉化率約為 70% ; 1996 年，Nishimoto 等人從 Thermus aquaticus ATCC 33923中分離到一種海藻糖合酶，以40%的麥芽糖為底物反應72h，轉化率約為70%。
【發明內容】
[0004]本發明的第一個目的是提供一種海藻糖合酶生產菌株，所述菌株為假單胞菌Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2015227。
[0005]所述菌株是從淀粉加工廠附近土壤中經菌株富集、平板菌落特征初篩，采用一級發酵逐一搖瓶培養，經酶活測定，比較海藻糖合酶活性大小而得到。
[0006]本發明的第二個目的是提供一種利用所述菌株生產海藻糖的方法，所述方法是以該菌發酵所得海藻糖合酶為催化劑，以麥芽糖為底物，催化生產海藻糖。
[0007]所述方法，在本發明的一種實施方式中，包括:以終濃度為5%?40% (W/V)的麥芽糖為底物，按照10?20U/g麥芽糖的量加入所述菌株發酵得到的海藻糖合酶，在pH7.0?8.0,30?50°C下反應8?12h。
[0008]所述方法，在本發明的一種實施方式中，海藻糖合酶是本發明菌株經種子培養和液體深層發酵生產得到的海藻糖合酶的粗酶液或濃縮酶液。
[0009]所述方法，在本發明的一種實施方式中，反應是在振蕩條件下進行的。
[0010]所述方法，在本發明的一種實施方式中，pH使用氫氧化鈉水溶液進行調節。
[0011]本發明的第三個目的是提供一種利用所述假單胞菌生產海藻糖合酶的方法，所述方法以Pseudomonas sp.WSH15-02菌株為生產菌株，經種子培養和液體深層發酵得到海藻糖合酶。
[0012]所述種子培養，在本發明的一種實施方式中，其種子培養基配方為蛋白胨1%、酵母粉0.5%、氯化鈉1%、ρΗ 7.0，培養條件為:30°0、搖瓶轉速200印111、培養10?14h。
[0013]所述液體深層發酵，在本發明的一種實施方式中，是在發酵培養基(麥芽糖2%，蛋白胨 0.5%，牛肉膏 0.2%, K2HPO40.1 %, NaH2PO40.1 %, MgSO40.05%,pH 7.0)中，于 30°C、200rpm 發酵 2 ?3d。
[0014]本發明篩選得到了一株表達海藻糖合酶的假單胞菌。用該菌生產的海藻糖合酶催化麥芽糖生產海藻糖，具有不受底物濃度影響、溫度范圍廣、沒有副產物葡萄糖的生成、反應方法簡便、低能耗、物料成本低、高效(反應8?12h即可)等優點，在較高底物濃度下仍能得到高底物轉化率，可達80%，而且在高溫50°C條件下仍能正常反應，可以避免糖類物質為底物容易導致的染菌現象，為工業化放大生產奠定基礎。
[0015]生物材料保藏
[0016]一株假單胞菌，分類命名為假單胞菌WSH15-02 Pseudomonas sp.WSH15-02，于2015年4月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為 CCTCC Ν0:Μ 2015227。
【具體實施方式】
[0017]培養基:
[0018](I)肉湯蛋白胨培養基:肉湯0.3%，蛋白胨0.5%，ρΗ7.0 ;
[0019](2)平板分離培養基:麥芽糖0.5 %，糊精2 %，蛋白胨0.5 %，牛肉膏0.5 %，K2HPO40.1 %, NaH2PO40.1 %, MgSO40.05%, NaCl 5% 以上，CaCl20.1%，瓊脂 2%, ρΗ7.0 ；
[0020](3)發酵培養基(g/L):麥芽糖2%，蛋白胨0.5%，牛肉膏0.2%，K2HPO40.1 %,NaH2PO40.1 %，MgSO40.05 %，ρΗ7.0 ；
[0021](4)種子培養基(g/L):蛋白胨1%，酵母粉0.5%，氯化鈉1%,ρΗ 7.0。
[0022]實施例1菌株的篩選
[0023]從3個淀粉加工廠附近分別采集土樣5份，共15份樣品。用滅過菌的藥匙取Ig土樣加入10mL肉湯蛋白胨液體培養基中，37°C、200rpm/min搖床培養36h，富集菌株；然后將富集后的菌液依次梯度稀釋(10'10_2、……10_7，)涂布于含有平板分離培養基的海藻糖合酶篩選平板上，30°C培養箱中培養2d，挑取大小、形狀、顏色不一的具有典型特征的單菌落在固體肉湯蛋白胨培養基上劃線分離，再挑取單菌落進行分離純化，反復3次，挑取典型單菌落在試管斜面上劃線，30°C培養10?14h后于冰箱中4°C保存。
[0024]將篩選到的菌株接種到發酵培養基中進行液體振蕩培養，培養溫度為30°C，搖床轉速為200rpm，培養時間為2?3d。培養液經過12000rpm離心5min收集菌體，將菌體懸浮于 ρΗ7.0 的 20mmol/L 的 KH2PO4-Na2HPOjl沖液中，超聲破碎 lOmin，12000rpm 離心 1min收集上清進行酶活測定，用HPLC測定生成的海藻糖含量。選取酶活高的菌株進行劃線傳代培養，最終得到一株產酶穩定的海藻糖合酶生產菌株。純化的菌株接種于牛肉膏蛋白胨斜面培養基上，4°C保藏。
[0025]最后，得到一株假單胞菌Pseudomonas sp.WSH15-02，將其于2015年4月13日保藏于中國典型培養物保藏中心，保藏地址為中國武漢武漢大學，保藏編號為CCTCCN0:M2015227o
[0026]實施例2發酵產酶
[0027](I)發酵培養
[0028]將實施例1中篩選得到的