一種根瘤菌及其菌劑和制備方法與應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種根瘤菌及其菌劑和制備方法與應用。
【背景技術】
[0002] 現代農業生產中隨著化肥的大量施用，農作物的產值、產量都有了很大的提高，同 時也導致了土壤有機質降低、土壤板結、土地生產力下降等一系列問題。土壤微生物具有促 進土壤養分轉化、活化土壤養分、增加養分供應的作用。土壤微生物參與土壤養分轉化的各 種生物化學反應，與土壤養分的供應和損失密切相關。在土壤中，有機質礦化與腐殖化、氮 素的硝化和反硝化、含磷鉀礦物的有效化等過程均有土壤微生物的參與，土壤微生物制約 著土壤氮、磷、鉀營養元素的供應和生物有效性，影響煙株的產、質量。而土壤養分大部分以 無效態存在，氮大部分為有機氮，含磷和含鉀礦物占土壤全磷鉀的95%以上。有機氮在微生 物的作用下礦化為無機氮，供給植物營養；土壤中的溶磷解鉀微生物能分泌甲酸、乙酸、草 酸、檸檬酸、丁二酸等，溶解含磷和含鉀礦物，釋放磷鉀，提高它們的生物有效性，改善作物 營養。在土壤中，存在共生固氮菌、自生固氮菌和聯合固氮菌等多種固氮微生物，通過不同 方式固定空氣中的氮，增加土壤的氮素養分，供給植物營養之需要。而一種微生物具有多種 作用的菌劑未見相關報道。
【發明內容】
[0003] 本發明第一目的在于提供一種根瘤菌，第二目的在于提供一種以所述根瘤菌作為 活性成分的菌劑，第三目的在于提供所述以根瘤菌作為活性成分的菌劑制備方法，第四目 的在于提供所述菌劑的應用。
[0004] 本發明第一目的是這樣實現的，所述的根瘤菌為放射根瘤菌 A32,保藏單位：中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2014年 11月21日，保藏編號：CGMCC No. 10031 ;所述根瘤菌屬于細菌界，變形菌門，α -變形菌綱， 根瘤菌目，根瘤菌科，根瘤菌屬。
[0005] --放射根瘤菌（Λ rat/ioAacier) Α32的獲得與鑒定 (1)放射根瘤菌（紀ier) A32的獲得與鑒定 本發明所述的放射根瘤菌，是采用硅酸鹽細菌培養基從楚雄市東華鎮煙田的紫色土壤 中分離出來，在硅酸鹽細菌培養基上選擇菌落透明、發亮、粘性較大的菌落再轉接到無機磷 細菌培養基上，出現溶磷圈后，記錄菌落直徑和溶磷圈大小，取溶磷圈較大的菌重新純化培 養，再挑到40%的滅菌干油管中4°C保存備用。
[0006] 所用培養基配方： 1、硅酸鹽細菌培養基： 蔗糖 5g、土壤礦物 I. 0g、MgSO4 · 7H20 0· 5g、CaCO3 0· lg、Na2HPO4 2. 0g、FeCl3 (1%) 0.21111、瓊脂2(^、蒸餾水 10001111邛!17.0~7.5。
[0007] 2、無機磷細菌培養基： 葡萄糖 10 g、（NH4)2SO4 0.5 g、NaCl 0.3 g、KCl 0.3 g、MgS04.7H20 0.3g、FeS04.7H20 0.03g、MnSO4 ·4Η20 0.03 g、CaCO3 5 g、Ca3(PO4)2 10g、瓊脂 18-20g、蒸餾水 1000ml、pH 7. 0~7. 5 〇
[0008] 對上述分離的菌株A32,通過常規方法進行生物學和生理生化特性檢測與分子生 物學方法鑒定。分子鑒定方法如下：細菌基因組DNA的提取用TaKaRa MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit Ver. 2.0,方法參見試劑盒說明書。PCR擴增選用引物F27/ R1492,常規條件擴增，擴增產物委托上海英駿生物技術有限公司進行序列測定。
[0009] 該菌呈桿狀，無芽孢，革蘭氏染色陽性，葡萄糖發酵陰性，接觸酶陽性，氧化酶陽 性，甲基紅試驗陰性，VP試驗陰性，硝酸鹽還原陽性.。
[0010] 16S rDNA序列分析：通過序列比對和生理生化特性將A32菌株鑒定為放射根瘤菌 (TP. radiobacter)。
[0011] (2 )放射根瘤菌（TP. rat/ioAac ier) A3 2 的保藏 通過上述鑒定結果，確認菌株A32為放射根瘤菌（TP. 的一個株系，命 名為A32,于2014年11月21日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心 (簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研宄所，郵編 100101)，其保藏編號為 CGMCC No. 10031。
[0012] 本發明第二目的是這樣實現的，是以所述放射根瘤菌rat/io知cier) A32經平 板培養、種子培養、發酵后制成的菌劑。
[0013] 本發明的第三目的是這樣實現的，包括平板培養、種子培養、發酵、菌劑制備步驟， 具體包括： A、 平板培養：將放射根瘤菌接種到平板培養基上，在溫度為 26~30°C下培養48~54h，得平板菌種； B、 種子培養：將平板菌種接種到液體培養基中，在溫度為26~30°C下搖床上培養 48~54h，得液體發酵種子； C、 發酵：將液體發酵種子按發酵培養基體積8~12%的量接種入發酵罐，在28~32°C下培 養36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到放射根瘤菌A32發酵液； D、 菌劑制備：在發酵液中加入吸附劑吸附經風干至水分含量重量比小于13%得到目標 固體菌劑。
[0014] 本發明第四目的是這樣實現的，所述菌劑直接施用于土壤，起到解磷、解鉀、提高 速效氮的作用。
[0015] 除非另有說明外，本發明中所采用的百分數均為體積百分數。
[0016] 本發明所述放射根瘤菌和以所述放射根瘤菌為活性成分的制劑的優點： 本發明所用的放射根瘤菌具有將土壤中難溶的無機磷、鉀分解成植物易于吸收的磷、 鉀的功能，同時提高土壤中全氮的含量。施用放射根瘤菌菌劑后可以促進土壤直接釋放不 被植物吸收的氮、磷、鉀養分，可以適當降低無機氮、磷、鉀肥料的施入；同時該菌是從煙田 土壤中分離得到的，通過增殖培養后再以有機肥的形式施入田間，對植煙土壤環境改良具 有較好的潛在應用價值。
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發明工藝流程圖。
【具體實施方式】
[0018] 下面結合附圖對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基 于本發明教導所作的任何變換或改進，均落入本發明的保護范圍。
[0019] 本發明所述的根瘤菌為放射根瘤菌（Λ A32,保藏單位：中國微生 物菌種保藏管理委員會普通微生物中心（CGMCC)，保藏日：2014年11月21日，保藏編號： CGMCCNo. 10031;所述根瘤菌屬于細菌界，變形菌門，α-變形菌綱，根瘤菌目，根瘤菌科， 根瘤菌屬。
[0020] 本發明所述的根瘤菌為活性成分的菌劑，是以放射根瘤菌Α32 經平板培養、種子培養、發酵后制成的菌劑。
[0021] 本發明所述的根瘤菌為活性成分的菌劑的制備方法，包括平板培養、種子培養、發 酵、菌劑制備步驟，具體包括： A、 平板培養：將放射根瘤菌接種到平板培養基上，在溫度為 26~30°C下培養48~54h，得平板菌種； B、 種子培養：將平板菌種接種到液體培養基中，在溫度為26~30°C下搖床上培養 48~60h，得液體發酵種子； C、 發酵：將液體發酵種子按發酵培養基體積8~12%的量接種入發酵罐，在28~32°C下培 養36~54h，攪拌速度為170~190 r/min，通氣量60~100%，得到放射根瘤菌A32發酵液； D、 菌劑制備：在發酵液中加入吸附劑吸附經風干至水分含量重量比小于13%得到目標 固體菌劑。
[0022] 所述的平板培養基、液體培養基和發酵培養基均為營養肉湯培養基，其成分為：蛋 白胨8~12g、牛肉粉4~6g、氯化鈉4~6g，其余為水，pH值為7. 0~7. 5 ;平板培養基成分還包括 瓊脂粉16~20g。
[0023] 所述的B步驟中所述搖床的轉速為100~110r/min。
[0024] 所述的C步驟中發酵培養時，投料量為發酵罐的70~80%。
[0025] C步驟中發酵罐培養時，發酵溫度為28~32°C，壓強為0.05MPa，攪拌速度為 170~190r/min，培養時間為 48h。
[0026] 所述的D步驟中吸附劑為硅藻土、草炭、發酵后的油枯或活性炭的一種或幾種，吸 附劑的粒徑為l~5mm。
[0027] 本發明的應用為所述菌劑直接施入土壤，起到解磷、解鉀、提高土壤速效氮的作 用。
[0028] 下面通過實施例加以說明： 實施例1 --以放射根瘤菌A32為活性成分的制劑的制備 取在營養肉湯平板上培養好的放射根瘤菌紀A32接種到裝有營養肉湯 液體培養液的250ml三角瓶中，在轉速為100-110轉/分的搖床上培養60小時后，按10% 的接種量再轉接到裝有液體培養液的組培蘭花瓶中，在轉速為100-110轉/分的搖床上培 養72小時后，用2倍體積粒徑為1-5_的草炭進行吸附，形成固體菌劑型。
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