一種雙網絡聚(N-丙烯酰基-L-α-氨基酸)/透明質酸復合水凝膠及其制備方法
【技術領域】
[0001]本發明屬于生物醫用材料技術領域，具體涉及一種雙網絡聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明質酸復合水凝膠及其制備方法。
【背景技術】
[0002]隨著三維細胞培養技術的快速發展，水凝膠越來越受重視，因為其不僅具有與活體組織類似的多孔彈性水合網絡，還利于氧、營養物質和代謝廢物在其中的傳輸，可為細胞粘附、增殖和分化提供理想的三維微環境。水凝膠已廣泛用于生物醫學研宄領域，如藥物或蛋白遞送、細胞遞送、生物粘合劑、組織工程、體外細胞三維培養等。其中，由天然高分子制備的水凝膠，如藻酸鹽、透明質酸、殼聚糖、膠原、絲素蛋白等，具有良好的生物相容性、生物可降解性、細胞粘附性等性質。制備水凝膠的交聯方法主要包括物理交聯和化學交聯兩種。物理交聯方法通常工藝簡單，但形成水凝膠強度不夠高，而化學交聯方法如光交聯、碳二亞胺法交聯、點擊化學交聯等可賦予凝膠高的力學性能。然而，單一化學交聯方法制備的水凝膠無法滿足較高應力環境下應用的要求，如骨或軟骨組織等。為提高水凝膠的力學性能，新的技術手段不斷出現，如雙交聯網絡結構水凝膠、互穿網絡水凝膠、納米復合凝膠和拓撲水凝膠等。
[0003]雙交聯網絡水凝膠由兩種三維聚合物網絡構成，可克服彼此缺點，具有良好的綜合性能，尤其是擁有較高的力學強度，近年受到越來越多的關注。如利用聚丙烯酸改性聚乙二醇形成互穿網絡結構水凝膠，可使聚乙二醇水凝膠模量提高3.2倍[Waters DJ, etal.Structure and mechanism of strength enhancement in interpenetrating polymernetwork hydrogels.Macromolecules, 2011, 44:5776-5787];由聚甲基丙稀酰化古蘭糖膠和聚甲基丙烯酰胺化明膠制成的雙網絡水凝膠不僅具有高達6.9MPa的斷裂應力，還可有效支持 NIH-3T3 纖維原細胞的生長[Shin H, et al.The mechanical properties andcytotoxicity of cell-laden double-network hydrogels based on photocrosslinkabIegelatin and gelIan gum b1macromolecules.B1materials, 2012, 33:3143-3152];再如，以中性寡聚(2，2-二甲基三亞甲基碳酸酯)-聚(乙二醇)_寡聚(2，2-二甲基三亞甲基碳酸酯)_ 二丙烯酸酯和甲基丙烯酸酯化透明質酸為原料，經兩步光化學交聯法制備的雙網絡水凝膠最大壓縮應力高達8.38MPa，可有效支持豬軟骨細胞生長[Fan CJ, et al.A toughdouble network hydrogel for cartilage tissue engineering.Journal of MaterialsChemistry B，2013，1:4251-4258]。盡管這些水凝膠具有較高的力學性能和良好的生物相容性，但是它們無法滿足細胞三維培養結束時需要細胞/基質快速分離的應用環境。因此，開發能響應刺激信號實現快速解離并具有良好力學性能和生物相容性的水凝膠，具有重要的研宄價值。
[0004]聚氨基酸(或稱為多肽)是一類具有良好生物相容性、酶特異性降解性和功能性的新型材料，其含有的功能性基團如-NH2、-COOH賦予其獨特的生物學性能，如堿性聚賴氨酸荷正電對蛋白質、DNA和細胞膜就有很強的親和性、可刺激免疫球蛋白和干擾素 β 的合成、抑制腫瘤生長[Kuo YC, et al.Chondrogenesis in scaffolds withsurface modificat1n of elastin and poly-L-lysine.Colloids and SurfacesB:B1interfaces, 2012, 93:85-91];酸性聚氨基酸能誘導仿生礦化和骨細胞分化[AmosiN, et al.Acidic peptide hydrogel scaffolds enhance calcium phosphate mineralturnover into bone tissue.Acta B1materialia, 2012，8:2466-2475]。另一方面，由L- α -氨基酸丙烯酰化衍生物經自由基聚合形成的聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)，同樣具有聚氨基酸的諸多性質，在生物醫學領域具有良好的應用前景，然而這類材料應用于生物醫學領域的研宄尚處于嬰兒期，在組織工程等領域的應用極少。這類聚合物形成的水凝膠脆性和模量均較大，單獨使用有一定限制。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在于提供一種雙網絡聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明質酸復合水凝膠及其制備方法。該方法制得的復合水凝膠的交聯網鏈中含有二硫鍵，具有快速的還原解離性質；且該復合水凝膠的荷電狀態、模量、降解性能、微孔結構等性質可靈活調控，在組織工程、三維細胞培養、體外腫瘤模型等生物醫學領域應用前景廣闊。
[0006]為達到上述目的，本發明采用的技術方案如下:
[0007]一種雙網絡聚(N-丙烯酰基-L-α -氨基酸)/透明質酸復合水凝膠的制備方法，包括以下步驟:
[0008]配制質量百分濃度為I %?4%的酰肼化透明質酸溶液，并將其pH值調至4?6.5 ;將N-丙烯酰基-L- α -氨基酸、N，N’ -雙丙烯酰基_L_胱氨酸、水溶性光引發劑和多端羰基聚乙二醇溶于蒸餾水中配成混合物溶液；按體積比為1: (0.5?2)將混合物溶液加入酰肼化透明質酸溶液中，混合均勻后置于模具中進行紫外光輻照，即得到雙網絡聚(N-丙烯酰基-L- α -氨基酸)/透明質酸復合水凝膠；其中混合物溶液中N-丙烯酰基-L- α -氨基酸的質量百分濃度為10%?30%，N-丙烯酰基-L-α -氨基酸、N，N’ -雙丙烯酰基-L-胱氨酸和水溶性光引發劑的摩爾比為100: (2.5?15): (0.1?0.8)，酰肼化透明質酸中的酰肼基團和多端羰基聚乙二醇中的端羰基團的摩爾比為1: (0.2?I)。
[0009]所述的酰肼化透明質酸是由分子量為20萬?500萬的透明質酸經碳二亞胺法接枝2，2’ - 二硫代二乙酰肼、3，3’ - 二硫代二丙酰肼或4，4’ - 二硫代二丁酰肼形成的，取代度為 10%?50%。
[0010]所述的酰肼化透明質酸的合成方法如下:
[0011]將透明質酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺和含二硫鍵的二酰肼溶于蒸餾水中配成混合溶液，混合溶液中透明質酸的質量百分濃度為0.2?2%，且透明質酸重復單元數、1-(3- 二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽、N-羥基琥珀酰亞胺、含二硫鍵的二酰肼的摩爾比為100: (12?55): (15?60): (96?660);將混合溶液的pH值調至4.5?5.5，室溫下攪拌反應24?48小時，反應結束后，反應體系依次經透析和冷凍干燥，得到酰肼化透明質酸。
[0012]所述的N-丙烯酰基-L- α -氨基酸為N-丙烯酰基_L_谷氨酸、N-丙烯酰基_L_天冬氨酸、Νε -丙烯酰基-L-賴氨酸、NS-丙烯酰基-L-鳥氨酸、N-丙烯酰基-L-丙氨酸、N-丙烯酰基-L-苯丙氨酸或N-丙烯酰基-L-纈氨酸。
[0013]所述的N-丙烯酰基-L- α -氨基酸的合成方法如下:
[0014]將L- α -氨基酸(其中L-賴氨酸和L-鳥氨酸為其銅絡合物形式)溶于水中形成質量百分濃度為5%?20%的L-α -氨基酸水溶液，將其置于冰水浴中攪拌冷卻，然后在0.5?2小時內滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，滴加過程中維持體系pH在8?9.5之間，其中滴加的氯仿溶液的體積為L-α -氨基酸水溶液體積的10%?25%，丙烯酰氯與L-α -氨基酸的摩爾比為(1.2?2):1 ;滴加完畢后在室溫下繼續攪拌反應4小時，隨后向反應體系中加入8?12倍體積的沉淀劑(采用銅絡合物時需先用L- α -氨基酸摩爾數1.5倍的8_羥基喹啉除銅)，沉淀劑為乙醇、甲醇、丙酮或四氫呋喃，然后收集沉淀物并真空干燥，得到N-丙稀酰基_L_ α -氨基酸。
[0015]所述的N，N’ -雙丙烯酰基-L-胱氨酸的合成方法如下:
[0016]將L-胱氨酸溶于NaOH水溶液中，形成濃度為0.05g/mL?0.5g/mL的L-胱氨酸溶液，其中NaOH與L-胱氨酸的摩爾比為2:1 ;然后對L-胱氨酸溶液進行冰浴冷卻，再向其中滴加丙烯酰氯的氯仿溶液，其中丙烯酰氯和L-胱氨酸的摩爾比為(2.1?2.3):1，滴加過程中維持體系PH = 8.0，滴加完成后將溫度升至室溫并維持I?4小時，再在零下20°C進行冷凍干燥；將冷凍干燥得到的物質溶于pH = 2的水中，得到質量百分濃度為5%?20%的溶液，然后用6?12倍體積量的丙酮沉淀，所得固體經真空干燥即得到N