新型人源化抗cd22抗體-單甲基阿里他汀e偶聯物及其制備方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物制藥技術領域，具體地說涉及一種新型人源化抗⑶22抗體-單甲 基阿里他汀E偶聯物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 研宄發現，在B淋巴細胞表面有很多特異性表達的決定簇分子（cluster of differentiation)，即 CD 分子，如：CD19, CD20, CD22, CD72 和 CD80 等；這些抗原分子 中，被作為藥物靶點而進行廣泛研宄，并且應用于臨床的主要有CD20和CD22兩個分子 (Cancer Res. 2012Nov 1;72(21) :5556-65. )。CD22,又稱唾液酸結合的免疫球蛋白樣凝集 素，是B細胞表面特異性表達的抗原分子，由于該分子只在B細胞和前B細胞膜表達，而在 祖B細胞和漿細胞膜表面沒有表達，因此被認為是治療非霍奇金淋巴瘤（Non-Hodgkin' s Lymphoma, NHL)的理想藥物（Eur J Immunol. 20120ct;42 (10) :2792-802.) 〇
[0003] RFB4抗體是鼠源的抗人CD22抗原的單克隆抗體，與CD22有很好的親和力和特 異性，但是由于鼠源抗體應用于人體會產生人抗鼠抗體（Human anti-mouse antibodies， HAMA)效應，從而限制了該抗體在臨床的應用。我們采用"互補決定區（complementarity determining region,⑶R) "移植和計算機輔助設計方法，將RFB4抗體進行人源化改造，成 功獲得了人源化的抗CD22單克隆抗體hRFB4,并獲得了該抗體序列的專利（授權公告號CN 103214578 B)〇
[0004] 抗CD22抗體雖然具有較強的靶向功能，但對腫瘤的治療效果有限，腫瘤抑制率僅 為10 % -20 %，鑒于此，抗⑶22抗體常被開發用于與細胞毒性藥物偶聯，利用抗⑶22抗體 的靶向性，將藥物定向運輸至靶細胞，并利用"彈頭"藥物較強的細胞毒性增強對腫瘤細胞 的殺傷作用。
[0005] 抗體藥物偶聯物（antibody drug conjugates, ADCs)由抗體、接頭和藥物三部 分組成，各組分的選擇及不同偶聯工藝的使用，對ADC的有效性及安全性有著極其重要 的影響。目前，國內尚無抗CD22抗體藥物偶聯物相關專利及文獻報道，僅有少量將二肽 接頭繳氨酸 -瓜氨酸（Val-Cit，vc)及影響微管聚合的單甲基阿里他汀E(monomethyl auristatin-E，MMAE)接頭及藥物組合應用于抗體藥物偶聯的報道（專利號：CN 103145847 B ;CN 103254317 B ;CN 103394083 A ;CN 1938046 B ;CN 102936281 B);現有工藝還不成 熟。
[0006] 國外現有的處于不同研發階段的基于抗CD22抗體的抗體藥物偶聯物（ADCs)包括 Pfizer 公司的 Inotuzumab ozogamicin、Roche 公司的 Anti-CD22-MCC_DM1 和 Pinatuzumab vedotin〇
[0007] Inotuzumab ozogamicin在CMC-544抗體的基礎上，使用具有酸不穩定性的腙鍵 接頭，和能與DNA小凹槽結合進而引起雙鏈DNA斷裂的毒素 Calicheamicin (參考文獻： Shor B et al.,Mol Immunol. 20140ct 7. pii : S0161-5890 (14) 00259-4. doi : 10. 1016 ； Kantarjian H et al·，Lancet Oncol. 2012Apr;13(4) :403-11.);腙鍵接頭為現有ADC技術 中，穩定性相對欠缺的接頭，此類接頭為酸不穩定性接頭，進入內含體及溶酶體內后，依靠 這些細胞器內的酸性環境進行降解，由于此類接頭表現出有限的血漿穩定性，因此對藥物 的安全性及有效性存在一定的負面影響：具有細胞毒性的藥物可在到達靶細胞位點之前就 已經釋放，進而對正常組織和細胞以及整個機體造成損傷，同時，ADC到達靶細胞之后，由于 藥物的提前釋放，導致有效釋放至腫瘤細胞中的藥物量減少，因此對靶細胞的殺傷能力下 降。
[0008] Anti-CD22-MCC-DMl 基于 HulOF4 抗體進行 ADC 開發，其中 Anti-CD22-MCC-DMl 通過不可切割的穩定的硫醚接頭與抑制微管組裝的美登素類毒素 DMl偶聯（參考文獻： Poison AG et al·，Leukemia. 2010S印；24 (9) :1566-73.專利號：US 8968741 Β2· ;EP 2446904 A2. ;EP 2447282 A2.)，不可切割的接頭，依賴于溶酶體內的蛋白水解酶對ADC的 蛋白部分進行降解，釋放出偶聯有一個賴氨酸殘基的藥物，此種形式的藥物具有較強的親 水性，不能釋放至靶細胞附近的其他細胞，因而不具備bystander效應，殺傷力略有欠缺， 此外，帶有一個賴氨酸殘基的藥物同游離態的藥物相比，其藥效也會下降。
[0009] Pinatuzumab vedotin同樣是基于HulOF4抗體進行ADC開發，使用可被溶 酶體內的蛋白酶如Cathepsin B等切割的二肽接頭Val-Cit(vc)及影響微管聚合的 Auristatin類毒素 monomethyl auristatin-E (MMAE)(參考文獻：Li D et al., Mol Cancer Ther. 2013Jul;12(7) :1255-65.專利號：US 20150010540 Al.)。此外，還有多種改造后的 抗 CD22 抗體 HulOF4 通過二肽接頭 Val-Cit 或 Phe-Lys 與 pyrrolobenzodiazepine (PBD) 類藥物進行偶聯（專利號：US 20140030279A1.)。此類偶聯中采用硫醇類還原劑二硫蘇糖 醇（DTT)對抗體進行部分還原，此種還原劑雖然能有效還原二硫鍵，但無法在酸性條件下 進行，且常易與肽段形成加合物，使質譜圖復雜難辨。
【發明內容】
[0010] 本發明的目的在于克服現有技術中的不足，提供了一種新型人源化抗CD22抗 體-單甲基阿里他汀E偶聯物及其制備方法和應用，本發明選取Val-Cit及MMAE的接頭及 藥物組合與抗CD22抗體進行偶聯，獲得其抗體藥物偶聯物。與使用相同接頭及藥物組合的 以CD22為靶點的ADC Pinatuzumab vedotin及相關專利文件（專利號：EP 2478912A1.) 中所提供的技術方案不同，本發明所使用的抗體為具有專利的hRFB4抗體（授權公告號CN 103214578B)，同時在偶聯工藝中使用膦類還原劑三羧乙基膦TCEP(Tris-(2-carboxyethy l)-phosphine hydrochloride)進行抗體的還原。相較于 Pinatuzumab vedotin 及相關 專利文件（專利號：EP 2478912 Al.)提供的偶聯工藝中所使用的硫醇類還原劑二硫蘇糖 醇（DTT)，TCEP能在較寬的pH范圍內使用且反應條件較為溫和、溶解性好、毒性較小，同時 TCEP不與蛋白質中的其他功能基團反應。基于此，本申請還對偶聯工藝進行了進一步優化， 制備出平均偶聯度在4左右，裸抗及偶聯度為8的組分均低于5%，單體含量大于95%，且 體內外藥效證實能特異性殺傷靶細胞的抗CD22抗體ADC。
[0011] 為實現上述目的，本發明所采用的技術方案如下：
[0012] 本發明提供了一種新型人源化抗CD22抗體-單甲基阿里他汀E偶聯物，以及該偶 聯物的制備方法；
[0013] 一種新型人源化抗⑶22抗體-單甲基阿里他汀E偶聯物，包括：⑶22單抗 hRFB4分子偶聯帶有二肽接頭Val-Cit及可自我降解的間隔單元PAB的毒素 MMAE，即 vc-PAB-MMAE，平均每個hRFB4分子偶聯MMAE的分子數為3. 5-4. 5。
[0014] 其制備方法包括如下步驟：
[0015] 步驟一：在hRFB4-制劑緩沖液中加入2-4倍摩爾量的磷酸三氯乙酯TCEP ;水浴攪 拌反應，使hRFB4被還原，鏈間二硫鍵打開，樣品于冰水浴中冷卻至冰點以終止反應；所述 hRFB4-制劑緩沖液包含組氨酸鹽酸鹽、二水海藻糖和吐溫20, pH為5. 5,反應在惰性氣體保 護下進行；
[0016] 步驟二：將所述步驟一反應體系中被還原的hRFB4換液至PBS/D中，pH為6. 5 ;其 中D為二乙烯三胺五乙酸；
[0017] 步驟三：將所述步驟二得到的hRFB4中加入帶有二肽接頭Val-Cit及可自我 降解的間隔單元PAB的毒素 MMAE，即vc-PAB-MMAE，進行偶聯反應；所述hRFB4與所述 vc-PAB-MMAE的摩爾比為1:4-8,反應在惰性氣體保護下低于4°C進行，反應時間為l_4h ;
[0018] 步驟四：將偶聯產物hRFB4-vc-MMAE換液到hRFB4-制劑緩沖液中，以去除所述步 驟三反應體系中的雜質；
[0019] 步驟五：將所述步驟四中的hRFB4_制劑緩沖液進行凍干處理；冷凍保存。
[0020] 優選地，根據上述方法制備出的hRFB4-vc_MMAE具備以下特征：裸抗及偶聯度為8 的組分均低于5 %，單體含量大于95 %。
[0021] 更加優選地，根據上述方法制備出的hRFB4-vc-MMAE被應用于靶向治療⑶22陽性 (CD22+)腫瘤藥物中。
[0022] 更加優選地，所述步驟一和所述步驟三中的惰性氣體為氬氣或氮氣。
[0023] 更加優選地，所述hRFB4-制劑緩沖液包含lOmmol/L組氨酸鹽酸鹽、質量百分比為 5%二水海藻糖和質量百分比為0. 01 %吐溫20。
[0024] 更加優選地，所述步驟四中，所述換液包含脫鹽柱或超濾換液系統。
[0025] 更加優選地，所述脫鹽柱包含G-25脫鹽柱。
[0026] 更加優選地，所述超濾換液系統采用30kD膜包超濾換液系統。
[0027] 其中，所述PBS為磷酸緩沖鹽溶液，phosphate-buffered saline。
[0028] 其中，所述vc-PAB-MMAE簡稱vcMMAE ;由江陰康泰諾生物技術有限公司合成；MMAE 的全稱為 monomethyl auristatin-E〇
[0029] 其中，所述hRFB4分子序列詳見專利CN 103214578 B中。
[0030] 其中，所述G-25脫鹽柱，不同規格型號的交聯葡聚糖用英文字母G表示，G后面的 阿拉伯數為凝膠得水值的10倍，G-25為每克凝膠膨脹時吸水2. 5克，G-25的分離范圍為 1000-5000Da，專為蛋白質脫鹽而設計。
[0031] 本發明與現有技術相比具有以下優點：
[0032] 本發明通過抗體藥物偶聯技術，獲得抗CD22單克隆抗體hRFB4的偶聯物 hRFB4-vc-MMAE，為一種新型人源化抗CD22抗體-MMAE偶聯物，該偶聯物既保留了 hRFB4的 靶向性，又充分利用MMAE的抑制微管聚合能力，從而更為有效的起到靶向殺傷腫瘤細胞的 治療效果；
[0033] 本發明所使用的Val-Cit(vc)二肽接頭，克服了腙鍵接頭在藥物有效性及安全方 面的缺陷，同時，可降解的間隔單元PAB確保了釋放后的藥物為游離的藥物MMAE本身，不攜 帶氨基酸殘基，確保藥物的有效性；
[0034] 與現有的偶聯工藝相比，本發明在抗體還原反應體系中，使用膦類還原劑三羧乙 基勝（TCEP) (Tris-(2-carboxyethyl)-phosphine hydrochloride)進行抗體的半還原， TCEP能在較寬的pH范圍內使用且反應條件較為溫和、溶解性好、毒性較小，同時TCEP不與 蛋白質中的其他功能基團反應，可確保反應的可控性和結果的一致性；
[0035] 本發明還對偶聯工藝進行了進一步優化，所制備出的偶聯物，平均偶聯度在4左 右，裸抗及偶聯度為8的組分均低于5%，單體含量大于