線粒體熒光染色劑3-雜芳基取代-2h-吲唑類衍生物的制備及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一類專一性標記線粒體的熒光化合物3-雜芳基取代-2片吲唑類衍生 物及其制備方法。
【背景技術】
[0002] 線粒體是絕大多數真核細胞中重要的細胞器，除了為細胞提供能量以外，還參 與諸多生理活動，如細胞分化、細胞增殖、細胞間信息傳遞和細胞凋亡等過程，同時還具 有調控細胞生長和細胞周期的能力[SM:(a)Green，D.R.;Reed，J.C.5bie/7c e· 1998, 281, 1309; (b) Li, Η. ; Kolluri, S. K. ; Gu, J. et al. Science. 2000, 289, 1159; (c) Maechler, P. ; ffollheim, C. B. Nature. 2001, 414, 807; (d) Henze, K.; Martin, ff. Nature. 2003, 426, 127; (e) Green, D. R. ; Galluzzi, L. ; Kroemer, G. Science. 2011, 333, 1109; (f) NunnariI, J. ; Suomalainen, A. Cell. 2012, 148, 1145; (g) Friedman, J. R. ; Nunnari, J. 2014,卻沃 335.]。專一性跟蹤檢測 細胞內線粒體的形態及分布有利于深入了解和研宄許多相關的生理活動[參見：（a) Hoye, A. T. ; Davoren, J. E. ; ffipf, P. ; Fink, M. P. ; Kagan, V. E. Acc. Chem. Res. 2008, 41, 87; (b) Yousif, L F. ; Stewart, K. M. ; Kelley, S. 0. ChemBioChem. 2009, 10, 1939.]。近年來，由于其高靈敏度、高分辨率以及快速的響應時間等特性，熒光成像技術已 經被廣泛應用于生物學和醫學等眾多領域之中，設計和開發對線粒體具有專一性識別作用 的焚光探針倍受關注[參見：（3)1^￥3206，￥.;311；[1]1083￥3，！1.;331：0，4.6七31.4/7供見 Chem. Int. Ed. 2011, 50, 5478; (b) Zhang, T. ; Zhu, X. ; Cheng, C. C. ff. et al. J. Am. Chem. Soc. 2011, 133, 20120; (c) Pierroz, V. ; Joshi, T. ; Leonidova, A. et al. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134, 20376; (d) Leung, C. ff. T. ; Hong, Y. ; Chen, S. et al. J辦?. CXe?. 5bc. 2013，7J5； 62.]。目前，市售的線粒體熒光標記試劑種類 較少，化合物結構相對復雜，光穩定性有待提升，價格普遍昂貴。更重要的問題在于，大多數 市售線粒體熒光標記試劑發射綠光和黃光，而發射紅光的標記試劑相對很少。相比于綠色 和黃色熒光標記試劑，紅色甚至近紅外（發射波長范圍：600~900 nm)熒光試劑在生物體內 具有由于更小的光損傷、更低的背景噪音干擾、更少的光散射以及更深的組織穿透能力等 特性，[參見：（a) Weissleder，R. Nat. Biotechnol. 2001, 19, 316; (b) Frangioni, J. V. Curr. Opin. Chem. Biol. 2003^ 7, 626/ (c) Hilderbrand, S. A. ; ffeissleder, R. Curr. Opin. Chem. Biol. 2010, 14, 71; (d) Guo, Z. ; Park, S. ; Yoon, J. et al. Chem. Sci. Rev. 2014, 4i, 16; (e) Lukinaviius, G. ; Umezawa, K. ; Olivier, N. et al. Nat. Chem. 2013, 5, 132; (f) Choi, H. S. ; Gibbs, S. L ; Lee, J. H. et al. 2013，J7，148.]，使得設計和開發結構簡單且具有長波長熒光發射的 新型線粒體熒光標記試劑迫在眉睫。
[0003] 聯雜芳基類熒光化合物由于具有可調控的發射波長，大的斯托克斯位移以及 較強的熒光發射等光物理特性，已經引起了人們的高度關注[參見：(a) Nesterov，E. E. ; Skoch, J. ; Hyman, B. T. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 5452; (b) ffakamiya, A. ; Taniguchi, T. ; Yamaguchi, S. Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 3170; (c) Park, H. J. ; Lim, C. S. ; Kim, E. S. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 2673; (d) Fukazawa, A. ; Kishi, D. ; Tanaka, Y. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2013, 52, 12091; (e) Kim, G. H. ; Haider, D. ; Park, J. et al. Angew. Chem. 及/. 2014，9271.]。許多基于聯雜芳基結構為核心的熒光染料也已經相繼上 市。吲唑類結構單元不僅廣泛存在于眾多天然產物、藥物分子以及生物活性分子中[參 見：Schmidt, A. ; Beutler, A. ; Snovydovych, B.及/r. J (??; 2008, 4073·]， 在最近幾年內也逐漸成為了構筑新型小分子熒光團的重要骨架之一[參見：（a) Ma，F.; Zhou, N. ; Zhu, J. et al. Eur. Polym. J. 2009, 45, 2131; (b) Vernekar, S. K. V.; Hallaq, H. Y. ; Clarkson, G. et al. J. Med. Chem. 2010, 53, 2324; (c) Lian, Y.; Bergman, R. G. ; Lavis, L. D. et al. J CXe?. 5bc. 2013, 7122·]。由于其 相對缺電的π-共軛特性，吲唑與富電雜環（噻吩、苯并噻吩、呋喃、苯并呋喃、吲哚、吡咯） 偶聯所得到的聯雜芳基結構單元存在明顯的分子內電荷轉移效應（ICT)。外加可調控電子 能力的助色基團的輔助可以有效地構筑具有更加強烈的ICT效應的小分子熒光團，使其發 射紅色熒光甚至近紅外熒光。
[0004] 然而，聯雜芳基類熒光化合物仍然主要通過傳統的環加成反應或過渡金屬催化的 C-X/C-M(X =鹵素或擬鹵素 ，M = SnR3, 8((?)2等）偶聯反應來構筑。這兩類反應通常存 在合成路線較長、步驟較多、反應條件苛刻、操作較為繁瑣、原材料難于獲得、官能團容忍性 較差以及副產物易造成環境污染等缺點，在很大程度上限制了快速合成具有優異光物理特 性的、對線粒體有專一性熒光顯影作用的聯雜芳基類化合物。本專利的目的不是"多樣化的 篩選"，而是直達目標。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于開發一類基于3-雜芳基取代2片吲唑骨架的專一性標記線粒 體的熒光探針試劑：利用高效、簡潔以及環境友好的C-H/C-H交叉氧化偶聯反應，快速合成 3_雜芳基取代2片吲唑類熒光分子庫，并將其運用于專一性標記細胞內線粒體的領域中。
[0006] 本發明利用2片吲唑類衍生物與富電雜環C-H/C-H的交叉氧化偶聯反應，高效、快 速地構建具有各種熒光發射波長的熒光分子3-雜芳基取代2片吲唑類衍生物。其結構通 式見附圖1。
[0007] 本發明解決該問題的技術方案是采用以下的原料及制備路線，如附圖2: (1) 在干凈、干燥的反應器中加入2片吲唑類衍生物、富電雜環、催化劑、氧化劑、添加 劑和溶劑，室溫下混合均勻，隨后在無水無氧條件下一 40~160 °C反應0. 1~720小時； (2) 反應完成后將反應管冷卻至室溫，加入二氯甲烷將反應體系稀釋，再經硅藻土過 濾，并用二氯甲烷洗滌，合并濾液，減壓移去溶劑，剩余物用硅膠柱層析分離純化，真空干 燥。
[0008] 其中，2片吲唑類衍生物的結構通式為：
其中R1和R 2分別為氫、烷基、烷氧基、烷基氨基、羰基、硝基、取代芳基和取代雜芳基中 的一種或兩種。其中取代芳基和取代雜芳基中的取代基團為烷基、烷氧基、酰胺基或羰基中 的一種或幾種。其中烷基、烷氧基、烷基氨基、酯基、酰胺基或羰基的碳鏈為碳個數為〇~40 的直鏈、支鏈或環鏈。
[0009] 富電雜環的結構通式為以下一種：
其中R3和R4基團分別為氫、鹵素、烷基、芐基、烷氧基、酯基、酰胺基、羰基、醛基、氰基或 取代芳基的一種或兩種。其中烷基、烷氧基、酯基、酰胺基或羰基中的碳鏈為碳個數為〇~40 的直鏈或支鏈。
[0010] 步驟（1)中，催化劑為鈀碳、四（三苯基膦）鈀、醋酸鈀、氯化鈀、二（乙腈）