3-差向異構酶的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種具有酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白，以及一種編碼所述蛋白的 核酸分子。本發明還涉及一種載體和一種含所述核酸分子的宿主細胞。本發明還涉及一種 用所述蛋白合成阿洛酮糖的方法，以及按這種方式制造的阿洛酮糖。
【背景技術】
[0002] 阿洛酮糖是一種"零熱量"甜味劑，并有認為與葡萄糖類似的甜度。其還具有類似 于其他醣類的填充和褐變屬性。阿洛酮糖的主要目標市場是食品和飲料制造商，在其產品 中，目前所用為葡萄糖、果糖或高果糖漿，而且正尋求顯著減少熱量卻不顯著改變糖成分所 賦予的其他屬性，如：填充作用、褐變、質地和甜度。
[0003] 在美國，阿洛酮糖并非通常認為是安全（GRAS)的物質，但目前有一項待定的GRAS 通知（GRN400)。阿洛酮糖存在于加工甘蔗和甜菜糖蜜、經蒸汽處理的咖啡、小麥植物產品 和高果糖玉米糖漿。阿洛酮糖的典型日總攝入量估計為每天0.2克以上。D-阿洛酮糖是 D-果糖的C-3差向異構體，而阿洛酮糖和果糖結構的差異使得阿洛酮糖不能被人體代謝， 因而其熱量為零。由于阿洛酮糖不含熱量，因此，認為其是一種有前途的候選甜味填充劑， 而且，據稱在具有甜味的同時還能保持與典型單糖相似的性質。
[0004] 酮糖-3-差向異構酶可使果糖和阿洛酮糖互相轉化。號為8030035的美國專利和 公布號為W02011/040708的PCT公開了可將來自農桿菌（Agrobacteriumtumefaciens)并 具阿洛酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白與D-果糖反應，從而制造D-阿洛酮糖（阿洛酮糖 的另一名稱）。
[0005][0006] 號為100832339的韓國專利公開了一種中華根瘤菌（Sinorhizobium)YB-58菌株， 該菌株能夠將果糖轉化成阿洛酮糖，并公開了一種用中華根瘤菌YB-58菌株的真菌體制造 阿洛酮糖的方法。
[0007] 號為1020090098938的韓國專利申請公開了一種用大腸桿菌制造阿洛酮糖的方 法，其中，大腸桿菌是表達一種編碼阿洛酮糖-3異構酶的多核苷酸。
[0008] 本發明的目的是改進阿洛酮糖的現有制備技術。本發明的目的是提供一種酮 糖-3-差向異構酶，其在全細胞系統中的轉化率和體積產率高于之前報導的。
【發明內容】
[0009] 本發明源于對三種酮糖-3-差向異構酶的鑒別及表征，其示例性氨基酸序列分別 示于編號2、4和6的序列。可用該酮糖-3-差向異構酶將果糖轉化成阿洛酮糖。之前已將 這些蛋白確定為假想蛋白，或確定為具有塔格糖異構酶活性。然而，本發明人現驚奇地發現 這些酶有阿洛酮糖-3-差向異構酶活性。
[0010] 本發明的第一方面提供一種含多肽序列的蛋白，該序列與編號2的序列、編號4的 序列或編號6的序列有至少70%的序列同一性，其特征在于，所述蛋白具有酮糖-3-差向異 構酶活性。
[0011] 方便而言，該多肽序列與編號2的序列，編號4的序列或編號6的序列有至少 80%、90%、95%或99%的序列同一性，或有100%的序列同一性。
[0012] 優選地，該多肽序列含編號13的序列。
[0013] 優選地，該蛋白固定于固體基質。
[0014] 本發明的第二方面提供一種本發明第一方面的蛋白用于合成阿洛酮糖的用途。
[0015] 本發明的第三方面提供一種核酸分子，該核酸分子包含編碼本發明第一方面所述 蛋白的多核苷酸序列。
[0016] 優選地，該核酸分子包含多核苷酸序列，其中：
[0017] i)該多核苷酸序列與編號5、編號1或編號3的序列有至少70%、80%、90%、95% 或99%的序列同一性，或是100%的序列同一性；或
[0018] ii)該多核苷酸序列在高度嚴謹條件下雜交得到一種多核苷酸，該多核苷酸具有 與編號5、編號1或編號3所不序列互補的序列。
[0019] 本發明的第四方面提供一種載體，其特征在于載體包含本發明第三方面所述的核 酸分子。
[0020] 本發明的第五方面提供一種宿主細胞，其特征在于宿主細胞包含本發明第三方面 所述的重組核酸分子。
[0021] 方便而言，該宿主細胞是一種酵母、細菌或其他微生物，或一種哺乳動物、植物或 其他細胞的培養物。
[0022] 優選地，該宿主細胞為大腸桿菌。
[0023] 本發明的第六方面提供一種由本發明第一方面所述蛋白制造的阿洛酮糖。
[0024] 本發明的第七方面提供一種制造阿洛酮糖的方法，包括：
[0025] i)提供本發明第一方面所述的蛋白；并
[0026] ii)在可將果糖基質轉化為阿洛酮糖的條件下將蛋白與果糖基質接觸。本發明亦 提供一種制造阿洛酮糖的方法，所述方法包括：在可將果糖基質轉化為阿洛酮糖的條件下， 將本發明第一方面所述蛋白與果糖基質接觸。
[0027] 優選地，所述蛋白存在于宿主細胞中。
[0028] 可選地，該蛋白呈分離形式。
[0029] 為方便起見，這些條件包括將蛋白與果糖基質保持在25°C至75°C之間，優選保持 在50°C至60°C之間，更優選保持在52°C至55°C之間，更優選為55°C。
[0030] 優選地，所述條件包括將蛋白和果糖基質保持在pH4至pH10之間。
[0031] 優選地，所述條件包括將果糖基質濃度保持在75%至95% (W/V)之間。
[0032] 本發明的第八方面提供一種含多核苷酸序列的核酸分子，其中：
[0033] i)所述多核苷酸序列與編號5、編號1或編號3的序列有至少70%的序列同一,性； 或
[0034]ii)所述多核苷酸序列在高度嚴謹條件下雜交得到一種多核苷酸，其具有與編號 5、編號1或編號3所示序列互補的序列。
[0035] 該核酸分子編碼一種具有酮糖-3-差向異構酶活性的多肽。如本發明的一方面所 述，該核酸分子可呈分離形式。
[0036] 本發明的第九方面提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含重組核酸分子，所述核酸 分子包含多核苷酸序列，所述多核苷酸序列編碼具有酮糖-3-差向異構酶活性的多肽，其 中該多核苷酸序列的特征在于：
[0037] i)與編號5、編號1或編號3的序列有至少70%的序列同一性；或
[0038] ii)在高度嚴謹條件下雜交得到一種多核苷酸，該多核苷酸具有與編號5、編號1 或編號3所示序列互補的序列。
[0039] 本發明的第十方面提供一種載體，所述載體包含核酸分子，所述核酸分子包含多 核苷酸，所述多核苷酸編碼具有酮糖-3-差向異構酶活性的多肽，其中該多核苷酸序列的 特征在于：
[0040] i)與編號5、編號1或編號3的序列有至少70%的序列同一,性；或
[0041] ii)在高度嚴謹條件下雜交得到一種多核苷酸，所述多核苷酸具有與編號5、編號 1或編號3所示序列互補的序列。
[0042] 本發明的第十一方面提供一種制備阿洛酮糖的方法，該方法包括下列步驟：
[0043] i)提供一種包含核酸分子的載體，所述核酸分子具有多核苷酸序列，所述多核苷 酸序列編碼具有酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白，其中該多核苷酸序列的特征在于：a)與 編號5、編號1或編號3的序列有至少70%的序列同一性，或b)在高度嚴謹條件下雜交得 到一種多核苷酸，所述多核苷酸具有與編號5、編號1或編號3所示序列互補的序列；
[0044] ii)合成具有酮糖-3-差向異構酶活性并被多核苷酸序列編碼的蛋白；
[0045] iii)將果糖與具有酮糖-3-差向異構酶活性的蛋白接觸，并將果糖和蛋白保持在 可將果糖轉化成阿洛酮糖的條件下；并
[0046] iv)至少對步驟iii)制造的阿洛酮糖進行部分純化。
[0047] 在本文中，術語"多肽"、"肽"和"蛋白"可互換使用，用以指代氨基酸殘基聚合物。 這些術語亦適用于一個或多個氨基酸殘基經修飾或殘基非天然存在的氨基酸聚合物，例如 天然存在氨基酸及天然存在氨基酸酸聚合物的相應人工化學模擬物。多肽未必呈"分離"形 式，即未必處于天然存在時其周圍組分之外。
[0048] 本文所用術語"氨基酸"指天然存在和合成的氨基酸，以及具有與天然存在的氨基 酸功能類似的氨基酸類似物和氨基酸模擬物。天然存在的氨基酸指由遺傳密碼編碼的氨基 酸，以及在細胞中翻譯后經修飾的氨基酸（例如：羥基脯氨酸、Y-羧基谷氨酸、0-磷酸絲氨 酸）。短語"氨基酸類似物"指與天然存在的氨基酸基本化學結構U碳與氫、羧基、氨基、 R基團結合）相同，但有一個經修飾的R基團或經修飾的骨干（如絲氨酸、亮氨酸、蛋氨酸亞 砜、蛋氨酸甲基锍）的化合物。短語"氨基酸模擬物"指一類與天然存在的氨基酸結構不同 但有類似功能的化合物。應當理解為：由于遺傳密碼的簡并性，編碼特定多肽的核酸分子可 能會具有一系列多核苷酸序列。例如：密碼子GCA、GCC、GCG和GCT都編碼丙氨酸這種氨基 酸。
[0049]使用BLASTP算法第 2.2.2 版（Altschul，StephenF.，ThomasL.Madden，AlejandroA.Schaffer,JinghuiZhang，ZhengZhang，WebbMiller，andDavid J.Lipman(1997)， "GappedBLASTandPSI-BLAST:anewgenerationofprotein databasesearchprograms"，NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)及默認參數，可確定兩 個序列的百分比"同一性"。尤其是，可用URLhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/訪問 互聯網進行BLAST算法評價。
[0050] 本文所用術語"酮糖-3-差向異構酶活性"指一種能催化酮糖的立體化學轉化，特 別是果糖向阿洛酮糖的轉化的酶。例如，在一個實施例中，"酮糖-3-差向異構酶活性"指與 相同條件下不含酶的反應混合物相比，所加每毫克酶（〇. 1單位/毫克）使果糖與阿洛酮糖 的互變率增加至少10微摩爾/分鐘的能力。在其他實施例中，認為使果糖與阿洛酮糖的互 變率增加至少〇. 05單位/毫克或0. 2單位/毫克即具有"酮糖-3-差向異構酶活性"。以下 提供了一種測定酶使D-果糖向阿洛酮糖轉化的活性的適宜方法。將