一種谷物粉狀食品中稻米成分的hda檢測方法及試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域，具體而言，本發明涉及一種檢測谷物粉狀食品中稻米 成分的HDA檢測方法及試劑盒。 技術背景
[0002] 隨著人們生活水平的日益提高，以及生活節奏的加快，越來越多的谷物粉狀食品 出現在人們的日常生活中。稻米在未加工前有特異的形態特征，容易與其它谷物進行區分， 但是如果將稻米制成粉狀，與其它粉狀的谷物相混合，則不易辨別。一些假冒偽劣商品標注 含有稻米成分，可能不含稻米成分，而用其它谷物代替；而一些標注不含稻米成分的商品， 卻可能添加了稻米成分。從谷物粉狀食品中檢測稻米成分是食品檢測與監督執法的一項任 務。
[0003] 目前谷物粉狀食品成分的檢測方法主要包括：感官法、化學法和近紅外光譜分析 法。
[0004] 利用感官法從不同谷物粉狀混合物中準確鑒定稻米成分難度較大，存在人為判斷 錯誤，不具有科學性和說服力。利用化學法檢測谷物成分是利用不同的化學試劑和谷物成 分進行反應，從而對其成分進行檢測和鑒定。谷物的化學成分一般都包括蛋白質、淀粉、月旨 類和無機鹽等。不同種類的谷物具有相似的化學成分，所以利用該方法從谷物粉狀混合物 中檢測稻米成分靈敏性和特異性較差。近紅外光譜分析法是目前較為常用的一種食品檢測 方法。該方法雖能對谷物成分進行檢測，但儀器要求較高，需要足夠的專業知識建立模型才 能進行分析，較為復雜；此外，對于不同種類的谷物混合粉狀樣品而言，測定時存在的背景 干擾也可能會影響檢測結果。
[0005] 依賴解旋酶 DNA 等溫擴增技術（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification，簡稱HDA)是由美國NEB公司于2004年發明一種核酸等溫擴增技術。該技 術只需在恒定溫度下進行，不需要溫度變化的過程，因此，在實際操作和儀器要求方面，HDA 技術都比普通核酸擴增技術（PCR)更為簡單和廉價，使樣品的檢測實現了快速、簡便和高通 量，從而更容易被開發出檢測的應用產品。
[0006] HDA技術原理是利用解旋酶在恒溫條件下解開DNA雙鏈，同時DNA單鏈結合蛋白 (SSB)穩定解開的單鏈為引物提供結合模板，然后由DNA聚合酶催化合成互補鏈，新合成的 雙鏈在解旋酶的作用下又形成單鏈，并作為下一輪合成的模板進入循環擴增反應，最終實 現靶序列的指數增長。該技術的優點在于：等溫擴增，HDA技術在一個恒定溫度就能完成擴 增反應，不需要像普通PCR那樣循環的溫度變化；操作簡便，HDA對引物的設計與普通PCR 相似，不需要復雜的引物設計，對于其他反應組分也不需要做任何特殊處理；設備簡單，HDA 反應不需要復雜的設備，只需要一個簡單的恒溫器就可進行。因此，HDA技術具有廣闊的應 用前景。
[0007] 目前尚未見利用HDA技術從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的報道。
【發明內容】
[0008] 本發明的目的是針對現有檢測技術的不足，提供一種能夠簡單、準確、快速、高通 量的從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的HDA檢測方法及試劑盒。
[0009] 為實現上述目的，本發明提供一種從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的HDA引物 對，所述引物對序列為SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示的序列。
[0010] 本發明還提供一種試劑盒，即含有SEQ ID No: 1和SEQ ID No: 2所示的引物對 的試劑盒。
[0011] 本發明所述檢測方法具體步驟為： 1、 從待測樣品中提取DNA作為檢測的模板； 2、 利用HDA引物對或者含引物對的試劑盒中的引物對，進行HDA反應，得到擴增產物； 3、 檢測擴增產物，并作出判斷。
[0012] 所述引物對序列為： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0013] 所述引物對由上海生工生物工程有限公司合成。
[0014] 所述的HDA反應體系為：5 yL的10 X緩沖液，0.2 μ mol的ATP，0.1 μ mol的 (11'011>8，10 11138七卩〇15〇116四86,5 48 1^。八蛋白，0.2 48 11￥扣]161;[。&86,25 4]\1海藻糖， 2 yL的10 ymol/L的上游引物，2 yL的10 ymol/L的下游引物，2 yL的樣品基因組 DNA，用 CldH2O 補至 50 μ L。
[0015] 所述的HDA反應方法為：將反應體系放入60-70°C恒溫金屬浴中恒溫擴增2h。
[0016] 所述的檢測擴增產物并作出判斷是采用瓊脂糖凝膠電泳的方法進行，出現205 bp 左右的特異性擴增條帶即判斷為檢測出稻米成分。
[0017] 本發明還提供了一種用于從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的試劑盒。
[0018] 本發明所述用于從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的試劑盒包括10X緩沖液， ATP，dNTPs，Bst polymerase，RecA 蛋白，UvrD heIicase，海藻糖，HDA 引物對，陽性對照 DNA 和 CldH2O0
[0019] 所述HDA引物對序列為： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0020] 所述引物對由上海生工生物工程有限公司合成。
[0021] 本發明的有益效果為：本發明的HDA引物對具有極高的特異性，僅能從稻米中擴 增出相應的特異性片段，可以對谷物粉狀食品中的稻米成分進行檢測，并且可以同時檢測 大量樣品，具有簡單、準確、快速、高通量的特點。
[0022] 本發明引物對是通過分析已報道的水稻和其它谷物葉綠體基因基因序列設 計。
[0023] 使用本發明的引物對進行檢測。谷類作物主要包括水稻、大麥、小麥、高粱、玉米、 大豆、薏苡等，因此分別購買每種谷物的5種不同生產廠家或者品牌進行檢測。實施例1顯 示，只有稻米特異性的檢測出205 bp的擴增條帶，其它谷物均未檢測出205 bp的擴增條 帶，準確率為100%。
[0024] 同時，從市場上購買10種不同的谷物粉狀商品，使用本發明的引物對進行檢測。 實施例2顯示，含有稻米成分的谷物粉狀商品可以檢測出205 bp的特異性條帶，而不含稻 米成分的谷物粉狀商品沒有檢測出205 bp的擴增條帶，檢測結果與商品包裝外的成分說明 相一致，準確率為100%。
[0025] 以上結果表明所提供的引物對具有很高的特異性、準確性和靈敏度，可用于谷物 粉狀商品中稻米成分的HDA快速檢測。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發明HDA法檢測不同谷物的試驗結果圖； 圖2為本發明HDA法檢測不同谷物粉狀商品的試驗結果圖。
【具體實施方式】
[0027] 下面將結合實施例對本發明作進一步詳細的說明。本發明實施例中所使用的實驗 方法如無特殊說明，均為本領域內常規方法。所用試劑或儀器未注明生產廠商者，均為可以 通過商業途徑獲得的常規產品。
[0028] 引物對的設計： 根據水稻葉綠體基因序列（Genbank序列號：粳稻Crjza 5? ii ra 0rsajCp015;秈稻 Crjza saiira ca:0rsaiCp08;野生稻 Crjza p010,即SEQ ID No:3;SEQ ID No:4;SEQ ID No:5)和其它谷物葉綠體基因沒序列 (Genbank 序列號：HvsvCp012、TraeCp012、SobiCp012、ZemaCp013、GnpaC_p061、ColajoC_ P〇ll)設計得到，具體引物對序列如下： SEQ ID No :1 :5' -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' ； SEQ ID No :2 :5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3'。
[0029] 引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。
[0030] 引物對的合成和試劑盒的制備： 根據上述核苷酸序列信息由上海生工生物工程有限公司合成引物對； 將上述合成好的引物對分別配制成濃度為10 Mmol/L的溶液作為試劑盒，備用。
[0031] 以下實施例所述的上游引物rpoB-F即為SEQ ID No :1，下游引物rpoB-R即為SEQ ID No :2〇
[0032] 樣品基因組DNA的提取(使用ZD Biotech植物種子DNA提取試劑盒提取檢測樣品 的基因組DNA ): 1) 取不同谷物樣品液氮充分碾磨成粉末狀。從中取約150 mg置于離心管中，加入600 KL ST溶液，渦旋震蕩30 s至樣品完全散開； 2) 加入10 PL RNase A以及10 PL蛋白酶Κ，漩渦混勻。37°C水浴30 min，并不斷搖 動； 3) 12000 rpm離心2 min。取200 PL上清液移入新離心管中，加入200 PL溶液GL，上 下顛倒混勻。加入200 PL無水乙醇，上下顛倒混勻； 4) 將混勻液體移入離心柱中，12000 rpm離心I min。取出離心柱并棄去收集管中溶 液，將離心柱放回收集管中； 5) 向離心柱中加入550 PL溶液Wl。12000 rpm離心I min。取出離心柱并棄去收集 管中溶液，將離心柱放回收集管中； 6) 向離心柱中加入550 PL溶液W2。12000 rpm離心10 sec。取出離心柱并棄去收集 管中溶液，將離心柱放回收集管中。12000 rpm離心2 min; 7) 將離心柱取出并放入I. 5 mL離心管中。向柱中加入50 μL預熱到50-60°C的滅菌 去離子水。靜置2-3 min，12000 rpm離心I min。DNA溶液即被收集在離心管中。
[0033] 擴增反應與電泳檢測： I) HDA反應體系和反應條件 以步驟3提取的基因組DNA為模板，進行HDA反應。
[0034] 反應體系為50 μL，即在0. 2 mL的PCR反應管中加入5 μ L的IOX緩沖液，0. 2 μ mol 的 ΑΤΡ，0.08 μ mol 的 dNTPs，10 U Bst polymerase，5 yg RecA 蛋白，0.2 yg UvrD 1161;^&86,25 4]\1海藻糖，2 41^的1〇41]1〇1/1^的上游引物印〇13-卩，2 41^的1〇41]1〇1/1^ 的下游引物rpoB-R，2 yL的樣品基因組DNA，用CldH2O補至50 yL。
[0035] 所述的HDA反應方法為：將反應體系放入60_70°C恒溫金屬浴中恒溫擴增2h。
[0036] 2)擴增產物的電泳檢測 用IXTAE電泳緩沖液制備1. 5%的瓊脂糖凝膠。取擴增產物與5 μL IOX上樣緩沖液 混合后，在已制備的瓊脂糖凝膠的點樣孔中進行點樣。設置電壓（3V/cm - 5V/cm)，電泳時 間為50 min - 60 min。用凝膠成像儀拍照記錄。
[0037] 采用上述引物對特異性擴增的稻米基因片段長度為205 bp，根據檢測樣品 是否產生205 bp的擴增條帶判定樣品中是否含有稻米成分。
[0038] 3)從谷物粉狀食品中檢測稻米成分的HDA方法的確定 實驗中所有谷物和粉狀樣品均來自大型超市或農貿市場，包含了谷物的主要種類：水 稻、小麥、大麥、玉米、高粱、大豆和薏苡，每種谷物分別購買5種不同的生產廠家或者品牌。 同時，購買10種不同的谷物粉狀商品，按上述方法分別提取基因組DNA，并進行HDA擴增，凝 膠電泳檢測結果。凝膠電泳結果見圖1和圖2。圖1顯示只有稻米能夠特異性檢測出205 bp的擴增條帶，其它谷物均未檢測出205 bp的擴增條帶，準確率為100%。圖2顯示，含有 稻米成分的谷物粉狀商品可以檢測出205 bp的特異性條帶，而不含有稻米成分的谷物粉狀 商品不能檢測出205 bp的擴增條帶，檢測結果與商品包裝外的成分說明相一致，準確率為 100% 〇
[0039] 圖1中M均為DNA marker，1-5為水稻樣品；6-10為小麥樣品；11-15為大麥樣 品；16-20為玉米樣品；21-25為高粱樣品；26-30為大豆樣品；31-35為薏苡樣品的HDA檢 測結果。圖2的泳道M為DNA marker，1-4為含有稻米成分的谷物粉狀商品，5-10為不含 有稻米成分的谷物粉狀商品的HDA檢測結果。以上結果表明所提供的引物對具有很高的特 異性、準確性和靈敏度，應用所提供的方法可對谷物粉狀商品中的稻米成分進行快速檢測。
[0040] :1:5, -AGCACCTTCTTGTTACCGCG-3' SEQ ID No:2:5' -GAACCGCATGTTGTAAACGA-3' SEQ ID No:3:梗稻（Crjza saiira /apoflica)的 基因序列（Genbank 序列號： OrsajCpO15) ATGCTCCGGAATGGAAATGAGGGAATGTCCACAATACCCGG