檢測乙醛脫氫酶2基因rs671多態性位點的引物、試劑盒及其PCR方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及分子生物學基因檢測領域，特別提供了一種檢測乙醛脫氫酶2基因多 態性的引物、試劑盒及其PCR方法，用于乙醛脫氫酶2基因 rs671多態位點的快速檢測。
【背景技術】
[0002] 有機硝酸酯類藥物用于治療心絞痛是通過釋放一氧化氮（NO)介導的，乙醛脫氫 酶2 (ALDH2)具有硝酸酯酶活性，可以將有機硝酸酯脫硝形成一氧化氮，是有機硝酸酯藥物 發揮療效的關鍵。如果病人ALDH2基因中攜帶有Glu504Lys (rs671)突變，變異基因編碼 的蛋白質結構具有差異，ALDH2的硝酸酯酶活性會降低10倍以上，突變型ALDH2 *2/2是 野生型ALDH2*1/1活性的6 - 7%，突變型ALDH2*l/2是野生型ALDH2*1/1活性的8 - 15%， 因此ALDH2突變型酶Lys504不能迅速將有機硝酸酯轉化為N0,導致心肌缺血情況加重，難 以發揮藥效。資料顯示，亞洲人群約5%-30%的個體都攜帶有ALDH2*2/2或ALDH2*l/2突 變。對于攜帶突變基因型(風險基因型）的患者，則不能完全把有機硝酸酯類藥物當作心絞 痛發作時的唯一藥品，因此，本試劑盒的適用人群為預期使用有機硝酸酯類藥物的患者，檢 測ALDH2基因型可預知含服有機硝酸酯類藥物的風險，為醫生合理使用有機硝酸酯類藥物 提供參考。
[0003] 此外，ALDH2基因的rs671 G > A型突變，直接導致ALDH2在乙醇代謝途徑中乙醛 脫氫成乙酸時活性的大幅度下降，使飲酒者體內乙醛大量儲積，乙醛的毒性會使飲者頭痛， 全身發紅，加重肝臟負擔。科學研宄發現這種突變還會增加人體患多種腫瘤尤其是食道癌 的風險，因此，本試劑盒還可適用于了解酒精代謝能力及酒精對身體危害程度的人群。
[0004] 目前對基因突變和基因多態性的檢測，常見有直接測序法；基因芯片雜交法； PCR-RFLP方法；PCR擴增產物毛細管電泳分析法；PCR-SSCP ;PCR高分辨熔解曲線分析技 術；PCR-Taqman MGB (Minor Groove Binder)探針法；AS-PCR 法；Cast-PCR 法等。這些方 法或多或少還存在儀器價格高，操作難度大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床 普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標本等缺點。
[0005] 如：1)直接測序法是突變分析的金標準，能發現已知和未知突變位點，但該法檢測 基因突變的靈敏度為20%(即目的基因的突變基因 DNA模板數占野生型DNA模板數的20%)。 同時還存在操作復雜，周期長，分析速度慢，常需要2天的時間，而且該法是開管操作，大大 增加污染的可能性，不適合對大規模標本的檢測，同時還需要昂貴的儀器，存在在基層不易 實施等缺點。
[0006] 2)普通PCR-RFLP方法技術簡便，價格便宜，適宜少量樣本的實驗室檢測，但RFLP 僅能檢測有酶切位點的突變，無酶切位點不能檢測，費時費力，還存在PCR產物污染導致 假陽性的風險，見[Mol Diagn Ther. 2010 Jun 1; 14(3) :163-9, United States Patent 20120135406]。
[0007] 3)芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用 于全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。
[0008] 4) PCR高分辨熔解曲線分析技術，能高通量檢測基因的突變情況，試劑成本較低， 但因其熒光信號來自染料，特異性受到影響，而且檢測儀器是升級版的熒光PCR儀，價格高 昂，普及受限，見[Clin Chim ACqa. 2012 Nov 12;413(21-22):1781-5; United States Patent 20110045479]〇
[0009] 5 ) PCR-Taqman MGB探針法適合已知突變位點，常常需要兩條探針，而Taqman MGB探針的合成價格是普通Taqman探針的幾倍，見[J Clin Microbiol. 2010 Aug;48(8) :2909-15 ;United States Patent 20090311679]，并且不能檢測樣本中的含量 較少（彡1，〇〇〇個中的1個）的等位基因或突變位點。
[0010] 6)PCR-SSCP法雖然簡單，但該法是開放性的檢測系統，容易造成PCR產物的污染， 而且操作步驟多，費時費力。
[0011] 7)等位基因特異性引物PCR擴增法（AS-PCR)，這一方法是目前檢測基因突變或 SNP最簡單快速的方法（Wu D Y, Ugozzoli L, Pal B K, Wallace R B·，Proc Natl Acad Sci USA 1989; 86:2757-2760)，其原理是引物3'末端堿基與模板的堿基錯配，其PCR的 效率將會下降 IO3-IO6.6倍（Chen, X·，and Sullivan, P F, The Pharmacogeonomics Journal 2003，3，77-96)。盡管該方法的原理簡單，但錯配的引物，依然會發生非特異 性擴增，擴增情況視突變的類型和檢測位點周圍的堿基序列相關（Ayyadevara S, Thaden J J, Shmookler Reis R J·, Anal Biochem 2000; 284:11-18)，還與樣本中存在的等位 基因變量的影響。為了增加 AS-PCR的特異性，許多科學家做了很多努力。大量的實驗證 明，該方法最關鍵的是設計與3'末端突變位點堿基互補或錯配的兩條特異引物，引物設 計不好，將導致高背景的交叉擴增，會導致較高的假陽性。盡管不少人努力將這一弊端克 月艮，如報道的TaqMAMA方法，在3'倒數第二位或第三位上引入突變堿基，的確可以增加 反應的特異性，但仍然無法完全消除假陽性，而且在純合子與雜合子的判斷上，缺乏標準， 會出現混亂的情況，見[J Virol Methods. 2008 Nov;153(2):156-62;Genomics. 2004 Feb; 83 (2) :311-20]。簡單的AS-PCR，通常采用PCR反應結束后再進行電泳，從有無反應 條帶來判斷結果，這種方法雖然不需要昂貴的儀器，但電泳操作，增加了 PCR的污染機會， 而且耗時費力。盡管有人對該方法作了改進，采用熒光定量PCR技術，但得到的不是"全或 無"式的結果，總會有非特異性反應的發生，即同樣的引物對野生型和突變型位點都會擴 增，只是其得到的Ct (Cycle threshold)不同而已，因此就引入了 ACt的概念，即ACt= 野生Ct-突變Ct，但計算復雜，如要Λ Ct值大于純合子Ct值判為突變型純合子，Λ Ct值 小于雜合子Ct值，判為雜合子，ACt值的引入不僅增加了操作步驟，還會引起混亂，因為 ACt值的設定標準無法準確定位，不同人員的操作、不同的標本和不同的檢測儀器都會有 不同的數字，給臨床應用帶來很大的困難，實際應用依然受限，見[中國專利CN101235415， CN101565742A]〇
[0012] 8)美國LIFE公司采用一種MGB封閉探針的方法，稱作Cast-PCR ( Competitive allele specific Taqman PCR)，用MGB探針將不檢測的位點封閉，然后用等位基因特異 引物熒光定量PCR的方法檢測目的位點，這雖然提高了檢測的特異性，但由于多加入一 條MGB封閉探針，勢必增加成本，對反應效率多少會帶來干擾，見[Exp Mol Pathol. 2012 Jun; 92 (3) :275-80; United States Patent 20100221717 ;CN102428190A]。有人采用鎖 核酸（LNA) ( Plant Method 2007, 3 :2)或修飾的堿基（Anal Biochem. 2005, 340 :287-294) 的PCR引物，可以使得AS-PCR檢測靈敏度提高。然而，這些方法增加了分析的總體成本，并 需對反應進行深度優化。
[0013] 目前，國內已上市有注冊證的ALDH2基因檢測試劑盒有如下一種：上海百傲科技 有限公司的"ALDH2(Glu504Lys)基因檢測試劑盒（DNA微陣列芯片法）"，國食藥監械（準） 字 2013 第 3400244 號。
[0014] 國內廣州達健生物科技有限公司申請的一種ALDH2基因的rs671基因突變熒光 定量PCR分型檢測試劑盒及其檢測方法(專利號CN 102851368 A)，采用的是突變位點雙 Taqman-MGB探針的熒光定量PCR方法；中國專利CN 102533958 A公開的檢測試劑盒，采用 常規PCR擴增結合Cold-PCR富集擴增產物的技術和高分辨熔解曲線分析技術，完成對樣 本ALDH2基因的rs671基因分型的判斷；廈門艾德生物醫藥科技有限公司則采用利用雙環 探針與特異性引物的雜交，檢測反應體系的FAM和HEX熒光強度，根據FAM和HEX熒光強 度判定結果(專利號CN 102453765 A);廣州益善生物技術有限公司申請的名為一種ALDH2 基因的rs671基因突變檢測液相芯片的專利(專利號CN 102234685 A)，即采用了液相芯片 技術對ALDH2基因的rs671突變情況進行檢測。
[0015] 芯片技術與傳統的儀器檢測方法相比具有高通量、微型化、自動化等特點，適用于 全基因組突變掃描，不適宜單個基因的突變位點檢測，且精度低，價格昂貴。而普通的熒光 定量PCR技術對最為關鍵的位點特異性引物設計，也僅按照引物設計的一般原則進行，沒 有一個好特異引物的篩選客觀指標，最為關鍵的是他們的結果判斷，依然模糊，沒有"全或 無"的概念，這樣非特異性的缺點還是無法克服。雙探針的熒光定量PCR方法，由于需要兩 條探針，而且常常是Taqman-MGB探針，大大增加了試劑成本，并且探針的設計和優化，條件 很高。高分辨熔解曲線分析技術雖然試劑成本低，但熒光染料是非特異性的顯示，先期的反 應條件優化、不同的更加昂貴的儀器和操作者的經驗往往決定結果的成敗。
[0016] 因此，如何對ALDH2基因 rs671多態性位點進行簡單準確的檢測，成為人們亟待解 決的問題。
【發明內容】
[0017] 鑒于此，本發明提供了一種檢測乙醛脫氫酶2基因 rs671多態性位點的引物、試劑 盒及其PCR方法，以至少解決以往試劑盒存在的結果判讀復雜、檢測儀器價格高，操作難度 大，存在一定假陰性和假陽性，檢測成本高，臨床普及程度低，不能同時大規模檢測臨床標 本等一個或多個問題。
[0018] 本發明提供的方案具體為：一種檢測乙醛脫氫酶2基因 rs671多態性位點的引物， 其特征在于，所述引物包括：野生型特異性上游引物、突變型特異性上游引物和野生型特異 性上游引物與突變型特異性上游引物共用的下游引物； 且所述野生型特異性上游引物具有SEQ No. 17序列，所述突變型特異性上游引物具有 SEQ No. 14序列，所述共用的下游引物具有SEQ No. 16序列。
[0019] 本發明一方面還提供了一種檢測乙醛脫氫酶2基因 rs671多態性位點的試劑，其 特征在于：所述試劑含有上述的引物。
[0020] 本發明另一方面還提供了一種檢測乙醛脫氫酶2基因 rs671多態性位點的試劑 盒，其特征在于：所述試劑盒也含有上述的引物。
[0021 ] 優選，所述試劑盒中還包括與所述引物配合使用的探針，其中，所述探針為Taqman 探針，具有SEQ No. 15序列。
[0022] 進一步優選，所述試劑盒還包括PCR反應管、dNTPs和Taq酶混合液、PCR緩沖液、 檢測管家基因 GAPDH的上游引物、檢測管家基因 GAPDH的下游引物和檢測管家基因 GAPDH 的探針、陽性質控品和空白對照； 所述檢測管家基因 GAPDH的上游引物具有SEQ No. 19序列；所述檢測管家基因 GAPDH 的下游引物具有SEQ No. 20序列；所述檢測管家基因 GAPDH的探針具有SEQ No. 21序列。
[0023] 進一步優選，所述突變型特異性上游引物、所述共用的下游引物、所述探針、所述 檢測管家基因 GAPDH的上游引物、所述檢測管家基因 GAPDH的下游引物和所述檢測管家基 因 GAPDH的探針被預先包被于A型PCR反應管內；以及與所述野生型特異性上游引物、所 述共用的下游引物、所述探針、所述檢測管家基因 GAPDH的上游引物